浆水中乳酸菌分离鉴定及其代谢特性的初步研究

孟宪刚,李雪萍,李建宏,谢佳佳,郑 楠

(兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州 730070)

浆水中乳酸菌分离鉴定及其代谢特性的初步研究

孟宪刚,李雪萍,李建宏,谢佳佳,郑 楠

(兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州 730070)

以浆水为材料,运用涂布法和平板划线法在选择性培养基上分离纯化其中的乳酸菌,并采用生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定相结合的方法鉴定其种属。发现浆水中含有多种乳酸菌,可归为5属17种。并用溶钙圈法选择17株菌进行产酸、降解胆固醇和亚硝酸盐实验,结果表明:实验菌株大多具有良好的产酸、降胆固醇和降亚硝酸盐功效,其中Q2、M5、H4、Q7、M2、H1等6株菌各方面性能都很优异,具有进一步开发利用之潜力。

浆水,乳酸菌,多样性,亚硝酸盐,胆固醇

浆水是将新鲜的芹菜等蔬菜投放入面汤或米汤后经多种微生物协同发酵而成的一种发酵食品[1]。传统浆水大多由自然发酵而成[2],在这一过程中不可避免的受到许多因素的制约和影响,例如原材料、加工温度等。在整个发酵过程中,任何一个环节的不慎都可能导致发酵异常甚至失败,自然发酵所需发酵时间较长,且发酵质量不稳定,不利于工厂化、规模化及标准化生产。采用人工接种发酵能避免自然发酵的不足,并且是实现浆水生产工业化的较佳加工方法。但目前人工接种发酵浆水的方法尚处于实验室研究阶段。其瓶颈之一是缺乏特性优良的纯培养发酵菌种。

乳酸菌是公认的最好的食品发酵菌种之一,乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值,改善食品风味,而且可以提高食品保藏性和附加值[3-4]。近年来还发现乳酸菌具有特殊生理活性和营养功能,如:乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群[5]、保持微生态平衡,提高食物消化率和生物价[6],降低血清胆固醇,控制内毒素,抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生,制造营养物质[6],刺激组织发育,从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用[7-9];由此可见,乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。可以说,如果乳酸菌停止生长,人和动物就很难健康生存。也正因为如此,乳酸菌被广泛用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业上。另外,食品安全和饮食健康问题正日益引起人们的重视,典型的如亚硝酸盐问题,而有诸多研究表明乳酸菌在活动过程中可有效降解亚硝酸盐,提高食品安全性[10-12]。因此筛选优良乳酸菌并研究其代谢特性就是非常重要的一项工作。

本文旨在筛选出具有优良功能特性的乳酸菌,综合运用菌落形态学、生理生化实验和分子生物学技术对其进行鉴定,随后研究其产酸特性,降解胆固醇及亚硝酸盐的能力等,为浆水的功能特性的研究以及优良乳酸菌制剂的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品 分别从西北五个地区取样,取样时参考当地食用习惯,在浆水处于风味最佳的阶段(无泡沫、味酸、浆水清澈、口感清爽)时取样,取得样品后,储存于无菌容器,低温运输至实验室,立即分离,采样地点如表1所示;细菌基因组DNA提取试剂盒 离心柱型,北京百泰克生物技术有限公司;2000bp DNA Ladder 美国Biomiga公司;十二烷基硫酸钠(SDS) 美国Sigma公司;十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 美国Sigma公司;乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 美国Sigma公司;Trise-饱和酚 美国Sigma公司;琼脂糖 BBI生物工程股份有限公司;β-巯基乙醇 天津市精细化工研究所 分析纯;异戊醇 分析纯,上海中秦化学试剂有限公司;PCR扩增试剂 上海生工。

表1 样品来源Table 1 Source of samples

台式离心机Centrifuge 5418R 德国艾本德公司;PCR仪MyCycler 美国伯乐生命医学产品公司;电泳仪HE-120 上海天能科技有限公司;凝胶成像仪2500 上海天能科技有限公司;紫外分光光度计Nano Drop 2000 美国赛默飞世尔科技公司;各型加样枪 德国艾本德公司;Sorvall legend RT离心机 美国Kendro实验室产品公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验所用培养基 MRS培养基;M17培养基;TYC培养基。

1.2.2 菌种的分离及筛选 用无菌生理盐水稀释浆水样本(样本稀释度以平板表面出现单菌落为度),涂布于平板培养基表面,37℃下培养48h后观察。挑选单菌落,再次用划线法分离纯化并镜检。挑选菌落形态统一、菌体显微形态一致的菌株进行后续实验。

1.2.3 菌株表型特征研究及乳酸菌的初步筛选 将1.2.1所选的菌株划线于平板上,培养至24～48h时观察并记录菌落形状、色泽、隆起、表面平整度、边缘形状等;取培养至24～36h的菌落涂片,用三步法做革兰氏染色,并在油镜下观察菌体形状和颜色(用Staphyloccocusaureus和Escherichiacoli做阳性和阴性对照)。

以上述观察结果为依据,选择菌落乳白色、光滑湿润、圆形,革兰氏染色结果为阳性的菌株进行进一步研究。

1.2.4 生理生化特征鉴定 将1.2.3所挑选出的菌株活化后,分别做以下实验[13-14]:接触酶反应实验、淀粉水解实验、明胶液化实验、石蕊牛奶实验、糖发酵实验、硫化氢产生实验、吲哚产生实验和乙酰甲基甲醇(V-P)实验,准确观察并记录实验结果。根据菌落形态、革兰氏染色结果及生化特性研究结果,参照《伯杰细菌鉴定手册》[15]、《常见细菌系统鉴定手册》[16]查询各菌株的分类地位。

1.2.5 分子生物学鉴定

1.2.5.1 DNA的提取 细菌用细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取。

1.2.5.2 DNA纯度及浓度分析 用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测。

1.2.5.3 设计与合成 细菌扩增引物为细菌16S rDNA扩增通用引物27F-1492R,序列分别为:27F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;1492R:5-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3,由北京华大基因研究中心合成。

1.2.5.4 扩增反应 扩增反应在梯度PCR仪上进行PCR反应,反应体系为(25μL):10×buffer缓冲液:2.5μL;l0mmol/L的Mg2+:1.5μL;25mmol/L的dNTP:0.5μL;20μmol/L的 PCR引物各0.5μL;5U/μL的Taq DNA聚合酶:0.25μL;约25ng/μL的模板DNA2.0μL;无菌双蒸水稀释至25μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s;55℃退火60s;72℃延伸30s;重复扩增40个循环;最后72℃延伸l0min;4℃保存。

1.2.5.5 扩增产物的检测与测序 反应产物检测通过琼脂糖凝胶电泳法完成,DNA Marker为2000bp DNA Ladder,将扩增出的产物的测序直接交北京华大基因研究中心完成。

1.2.6 微生物种属确定 综合生理生化鉴定结果与分子生物学鉴定结果,确定微生物的种属。

1.2.7 溶钙圈实验 将各菌株活化后点接于含2%碳酸钙的MRS、M17、TYC培养基中,选取溶钙圈相对较大的菌株进行后续实验。

1.2.8 各菌株产酸性能的测定 将各株乳酸菌增菌培养24h后连续活化3代,以2%的接种量接入MRS培养液中,每隔8h取样测定其pH,测至72h。

1.2.9 各菌株降解亚硝酸盐性能的测定 采用盐酸萘乙二胺法[17]做亚硝酸盐标准曲线,得出标准方程。将连续活化3次后的乳酸菌以2%的接种量接种到含亚硝酸钠(10mg/L)的培养基中,每12h取样,采用盐酸萘乙二胺法[17]测亚硝酸盐,测至72h,记录实验结果,根据标准曲线方程计算亚硝酸盐的含量。

1.2.10 各菌株降解胆固醇性能的测定 采用邻苯二甲醛法[18]做胆固醇标准曲线,得出标准方程。将增菌培养连续活化3代后的乳酸菌以2%的接种量接种到高胆固醇培养基中,分别在24、48、72h时取样,用邻苯二甲醛法[18]测定胆固醇的含量,准确记录实验结果,根据标准方程计算胆固醇含量和降解率。

1.3 数据处理与结果分析

DNA序列使用软件DNAMAN4.0进行分析;利用clustalx1.83对序列分别进行比对;在clustalx1.83中实现“掐头去尾”;BLAST获得相似序列。

亚硝酸盐降解和胆固醇降解相关数据作图采用spss19.0软件完成。

在GenBank获得与实验菌株亲缘较近的菌株16S rDNA测序作为参比序列,用clustalx1.83进行序列比对,使用MEGA5.1.2构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的初步筛选与表型特征的鉴定

以形态特征和革兰氏染色结果为依据,初步筛选出菌落乳白色、光滑湿润、圆形,革兰氏阳性的菌株59株。

2.2 生理生化特征鉴定

根据表型特征鉴定结果及生理生化特征鉴定结果,参照《伯杰细菌鉴定手册》[15]、《常见细菌系统鉴定手册》[16],查询其分类地位,结果如表2。

表2 生理生化特性鉴定结果Table 2 Identification results of physiological and biochemical characterization

鉴定并记录实验菌株的接触酶反应和淀粉水解等9项反应特征,并结合形态特征和革兰氏染色结果,分别与《伯杰细菌鉴定手册》[15]和《常见细菌系统鉴定手册》[16]中描述的反应特征相对比,发现所有实验菌株在鉴定手册中均能找到指标完全吻合的对应菌株,大部分甚至能鉴定到种,说明本研究中特征实验选取恰当,实验结果准确可靠。

2.3 分子生物学鉴定结果

如表3所示,分子生物学鉴定结果和生理生化特性鉴定结果吻合良好,两种方法互相印证,说明鉴定准确,而且大部分都鉴定到了种,也说明了分子生物学鉴定方法的优越性。另如图1所示,从系统发育学的角度,本研究分离出的59株细菌的16S rDNA序列与GenBank中序列的相似度均在98%以上,可以确定其分属为乳球菌属Lactococcus、乳杆菌属Lactobacillus、明串珠菌属Leuconostoc、链球菌属Streptococcus、短杆菌属Brevibacterium等5属17种。说明浆水中乳酸菌多样性较高。

2.4 溶钙圈实验结果

根据乳酸菌降解胆固醇、降解亚硝酸盐的机理,降胆固醇及亚硝酸盐菌株都是产酸的,因而采用碳酸钙平板透明圈法就可以初步筛选能产酸、能降解胆固醇与亚硝酸盐的菌株,本研究中,结合革兰氏染色结果和菌落形态观察结果,选取了溶钙圈大而明显的菌株(N8、H8、M15、Q19、L14、L15、Q2、M5、H4、Q7、N12、N3、L11、M2、H1、H16、M14等17株)进行后续研究。

2.5 各菌株产酸性能测定

如图2所示,本研究分离的各实验菌株产酸能力和产酸规律差别较大,如N3、N14和L11等菌株培养液中pH始终在5.5左右,而H16、N8等菌培养液pH在72h时降到了4以下。但是总体来看,大部分实验菌株都具有良好的产酸性能;就产酸规律来看,菌株M14、N12、L11产酸不明显,菌株N3和M15的pH呈现先降低后升高再降低的趋势;其余菌株pH均先下降,后逐渐趋于稳定。

2.6 各菌株降胆固醇能力测定

表3 分子生物学鉴定结果Table 3 Molecular identification results

如图4所示,实验菌株都有一定的降解胆固醇的能力,且整体呈现随培养时间延长降解率增高的趋势。但是,不同菌株其降解率差别较大,如菌株L14在72h的降解率在25%以下,而菌株M2达到了80%以上,相差3倍多。降解能力较强的菌株有:Q2、M5、H4、Q7、M2、H1、M14,其中,M2的最终的降解率高达92.28%。远超过了前人们从各种样品中分离的菌种的胆固醇降解率[19],也反映了浆水的优良特性。

图1 乳酸菌系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of Lactobacillus

2.7 各菌株降解亚硝酸盐能力的测定

亚硝酸盐是引起发酵蔬菜安全问题的主要原因,由于蔬菜本身含有硝态氮,在某些微生物的活动下很容易产生亚硝酸盐,而过量的亚硝酸盐对人体有毒害作用,因此,去除发酵蔬菜中亚硝酸盐就是发酵蔬菜制作中非常重要的一个方面。如图5所示,本研究筛选出的菌株都能较好的降解亚硝酸盐的能力,且培养液中亚硝酸盐的降解率随时间延长而增大,另外,不同菌株对亚硝酸盐的降解率不同。

图2 各菌株产酸结果Fig.2 Produce acid results of strains

图3 胆固醇及亚硝酸盐标准曲线Fig.3 Cholesterol and Nitrite standard curve 注:1.胆固醇曲线:Y=0.003862857142857143x+ 0.0004285714285714389,R2=0.995 (曲线估计时为0.995,直线估计为0.998) 2.亚硝酸盐标准曲线:Y=0.6787719298245615x+ -0.005321637426900604,R2=0.997 (曲线估计时为0.997,直线估计为0.998)

图4 实验菌株降解胆固醇结果Fig.4 The results of experimental strains degraded cholesterol

图5 实验菌株降解亚硝酸盐结果Fig.5 The results of experimental strains degraded nitrite

综上,就产酸、降解胆固醇和降解亚硝酸盐性能等综合来看,较为突出的菌株有乳酸乳球菌3株,分别为:Q2(乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcuslactiscremoris)、M2(乳酸乳球菌乳亚种Lactococcuslactislactis)和H1(乳酸乳球菌乳亚种Lactococcuslactislactis),乳酪短杆菌2株:M5(乳酪短杆菌Brevibacteriumcasei)和H4(乳酪短杆菌Brevibacteriumcasei),另有一株菌Q7(棉籽糖乳球菌Lactococcusraffinolactis)。以上几株菌都是较为常见的乳酸菌,其中乳酸乳球菌在食品和药物生产中都有极广泛的应用,如在乳制品的发酵[20]、生物化工产品的生产[21]、医疗及科研[22]等。而棉籽糖乳球菌和乳酪短杆菌的应用目前报道还较少。本研究结果显示了以上6株菌在诸多方面都有优良的表现,因此,是极有开发利用前途的微生物资源。

3 讨论

如上所述,本研究所分离菌种大多是具有潜在优良功效的乳球菌或乳杆菌,如益生功效[23],张莉等[24]以植物乳杆菌K25和C88为菌种,研究了乳酸菌的益生功效,结果表明:植物乳杆菌C88具有调节肠道菌群的作用,而植物乳杆菌K25干酪有助于降低心血管疾病的发生率。另有张董燕等[25]的研究表明乳杆菌能够提高生长猪氮表观消化率,改善血清指标,减少应激。诸如此类,大量的研究证据都显示乳酸菌具有出色的益生功效,总结起来,可以归结为促进胃肠道健康、促进胆固醇降解、增强免疫力、延缓衰老等几个方面;除此之外,乳酸菌还具有改善蔬菜品质的功效,研究发现,经乳酸菌活动后,蔬菜风味得以改善[26]、蔬菜安全和营养价值得以提高[27-29]等。除了上述两个方面的作用外,某些乳酸菌还可产生细菌素,是良好的生物保鲜剂,其具有抗菌保鲜作用且对人体无毒副作用,可以防止浆水的霉变腐败,可改善食品质量和食品安全的天然化合物,具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值[30-31]。如研究发现[32]戊糖乳杆菌产生的戊糖乳杆菌素对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有较强抑制作用,因其抑菌谱较广,对多数致病菌和食品腐败菌有较好抑菌作用,目前已有小规模的应用。但是另一方面,不同菌株之间的差别是很大的,因此,本研究分离出菌株的功效还需进一步实验论证。

本研究产酸实验中,菌株N3和M15的pH呈现先降低后升高再降低的趋势,这一结果与理论预测和前人研究得出的规律[33]相反,其可能的原因之一是杂菌污染,但其后经过多发酵液中微生物镜检和菌落形态检验,未发现杂菌,且重复实验均出现这一现象,可排除杂菌污染的可能。因此,其最可能的原因就是该菌株本身代谢特性较为特殊,需要从该菌酶系组成加以研究。

4 结论

4.1 浆水中含有多种乳酸菌,可归为5属17种。

4.2 实验菌株大多具有良好的产酸、降胆固醇和降亚硝酸盐功效,但不同菌株产酸、降胆固醇和降亚硝酸盐的能力各不相同。

4.3 Q2(乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcuslactiscremoris)、M5(乳酪短杆菌Brevibacteriumcasei)、H4(乳酪短杆菌Brevibacteriumcasei)、Q7(棉籽糖乳球菌Lactococcusraffinolactis)、M2(乳酸乳球菌乳亚种Lactococcuslactislactis)、H1(乳酸乳球菌乳亚种Lactococcuslactislactis)等6株菌各方面性能都很优异,具有进一步开发利用之潜力。

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Isolation and identification of lactic acid bacteria from Jiangshui and preliminary study on metabolic characteristics

MENG Xian-gang,LI Xue-ping,LI Jian-hong,XIE Jia-jia,ZHENG Nan

(College of Chemistry and Bioengineering Sciences,Lanzhou jiaotong University,Lanzhou 730070,China)

Jiangshui as the experimental material and Lactic acid bacteria(LAB)were isolated and purified on the selective culture medium by spread plate method and streak plate method. The species were identified by combining physiological and biochemical characteristics and molecular biology method. It found that there were various lactic acid bacteria which were classified into 5 genus and 17 species in Jiangshui. 17 LAB strains were selected by calcium-dissolving and the strains were used for produced acid,degraded cholesterol and nitrite experiment. The results showed that most of the selected strains had good produced acid,degraded cholesterol and nitrite ability,which Q2,M5,H4,Q7,M2,H1 were better in all aspects,with a potential of development and utilization.

Jiangshui;lactic acid bacteria;diversity;nitrite;cholesterol

2014-01-09

孟宪刚(1974-)，男，教授，博士，研究方向：食品发酵工程。

2012甘肃省财政厅生物专项项目(213001)；2011甘肃省财政厅高等学校基本科研业务费项目(211135)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)01-0181-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.029