噬菌体展示技术定位主要食物过敏原表位的研究进展

袁水林,李 欣,*,陈红兵,高金燕,熊 鼎

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047；2.南昌大学生命科学与食品工程学院,江西南昌 330047；3.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047)

噬菌体展示技术定位主要食物过敏原表位的研究进展

袁水林1,2,李 欣1,2,*,陈红兵1,3,高金燕2,熊 鼎1,2

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047；2.南昌大学生命科学与食品工程学院,江西南昌 330047；3.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047)

噬菌体展示技术是一项可以在噬菌体颗粒的表面展示外源多肽的体外筛选技术。由于该技术实现了基因和蛋白质的体外统一,现已被广泛应用于生命科学和医学等领域。目前噬菌体展示系统主要有丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。本文主要介绍了噬菌体展示技术以及该技术在八类食物抗原表位分析的应用。

噬菌体展示技术,噬菌体展示系统,食物过敏,表位,应用

食物过敏反应也称食物变态反应,是一种免疫学变态反应。在发达国家中,超过25%的人口患有I型超敏反应,如过敏性哮喘、鼻炎等[1]。近年来,食物过敏的患病率呈上升趋势[2],大约有5%的儿童和3%～4%的成年人对食物过敏[3]。表位(epitope)又称抗原决定簇,是过敏反应的物质基础,按其受体的不同可以分为B细胞表位和T细胞表位；按其结构的不同,分为连续性表位(线性表位)和不连续表位(构象性表位),前者指在过敏原中能与抗体结合的氨基酸为连续序列,由5～7个氨基酸组成；后者指在过敏原中能与抗体结合的氨基酸为分布于肽链不同部位或不同肽链,由15～22个氨基酸组成[4-5]。在自然状态下,过敏原蛋白的绝大部分表位为构象性表位,同时有些连续性表位也是不连续表位的组成部分[6-7]。连续性表位存在于B细胞表位和T细胞表位中,而不连续表位只存在于B细胞表位中[8-9]。

噬菌体展示技术(Phage display technology,PDT)是一种能够将所需性质的多肽从含有大量变异体的集落中提取出来的体外筛选技术[10]。将外源目的基因融合到噬菌体衣壳蛋白基因中,使噬菌体表面展示该基因编码的蛋白,由于噬菌体含有了该外源目的基因,因此它建立了基因型与表型的直接对应[11-12]。自从1985年Smith首次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因PⅢ中建立该方法以来[13],噬菌体展示技术已经发展成为了一种发现新特性多肽以及改变已有多肽性质的强大工具[10]。1990年Scott等首次应用噬菌体随机多肽库来研究筛选抗原模拟表位(mimotope)[14]。通过特异性的靶分子从噬菌体肽库中筛选出模拟表位的阳性克隆子,应用生物信息学的方法来定位过敏原表位[15]。这种新的分析方法较传统的分析方法有许多优点,它操作简单、成本相对较低,容易筛选到保留其抗原反应性的模拟表位,在分析食物蛋白抗原表位的应用中具有广阔的前景。

1 噬菌体的展示系统

噬菌体载体(carrier phage)是构成噬菌体展示技术的重要部分,根据表达外源蛋白的噬菌体类别的不同,噬菌体展示系统(phage display system)主要分为丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统[13,16-18],因每种展示系统都有各自的优缺点,因此选用最适合的噬菌体展示系统来研究能够达最为理想的目的。

1.1 丝状噬菌体展示系统

丝状噬菌体(filamentous phage)主要包括:丝状噬菌体f1、fd、和M13,这些噬菌体性质相似,含有5个编码衣壳蛋白,PⅢ、PⅥ、PⅧ、PⅦ和PⅨ。其中PⅧ为主要衣壳蛋白,其余为次要衣壳蛋白。在丝状噬菌体展示系统中,PⅢ蛋白和PⅧ蛋白为主要展示蛋白。PⅧ蛋白所需要展示的序列一般插入到PⅧ蛋白的N端,并且位于信号肽序列和编码成熟蛋白序列起始处之间。但是每个拷贝的PⅧ蛋白所展示的肽段非常短,大约6～8个残基。更长的肽段会阻止颗粒的包装,原因可能是与噬菌体体外所经过的PⅣ通道的大小限制有关。若需要在PⅧ蛋白上展示更长的肽段,可以通过噬菌粒载体进行展示,这样可以产生野生型PⅧ蛋白为主的杂合病毒颗粒。PⅢ蛋白在展示中最为常见,它含有N1、N2和位于C端的CT三个结构域。与PⅧ相比,PⅢ能够插入大片段肽段、与单价相容、有大量的载体适用,但是大片段肽段的插入有可能会使噬菌体的感染能力降低,而且有时降低非常明显,这个缺陷同样可以通过噬菌粒产生带有野生型PⅢ蛋白的杂合子噬菌体来解决[10]。目前,NEB公司生产的Ph.D.-7、Ph.D.-12、Ph.D.-C7C都是以该噬菌体为展示系统。

图1 丝状噬菌体展示外源基因的图示Fig.1 Filamentous phage display icon of exogenous gene

1.2 λ噬菌体展示技术系统

λ噬菌体展示系统是将外源多肽或蛋白质与λ噬菌体头部组装的必需蛋白D蛋白或λ噬菌体的主要尾部蛋白PV融合而被展示的[19]。λ噬菌体是在宿主细胞内完成装配的,不需要将外源多肽或蛋白质分泌到细菌细胞膜上,可展示有活性的大分子蛋白(100ku以上)以及对宿主细胞有毒性的蛋白。因此,跟前面提到的丝状噬菌体相比,它可展示的外源多肽或蛋白质范围更加广泛,同时还适合展示那些难以被E.coli分泌的复杂蛋白质[20]。目前,已经通过构建 λ 噬菌体的完整基因组文库发现了新的肺炎支原体抗原,这是一种常导致儿童和青少年非典型肺炎的支原体[21]。

1.3 T4噬菌体展示系统

T4噬菌体基因组为线状排列的双链DNA,扁长的二十面体衣壳,在噬菌体衣壳的外表面包被着两种非必需外壳蛋白:SOC(small outer capsid protein)和HOC(highly antigenic outer capsid protein),它们在T4噬菌体衣壳组装后结合到衣壳外表面[22]。T4噬菌体展示系统就是将外源多肽或蛋白质分别与SOC位点的C末端和HOC位点的N末端融合而展示于T4噬菌体表面[23-24]。与λ噬菌体展示系统一样,T4噬菌体是在宿主细胞内组装,被组装的融合蛋白不需通过分泌途径,因而其适用范围广泛,特别对研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质比较适合。另外,T4噬菌体也能在体外组装,这对构建表面展示噬菌体十分方便。该系统在生物工程学、蛋白质的免疫学展示与蛋白质之间相互作用等方面的研究具有相当广阔的应用市场。覃健萍等证明了展示在T4噬菌体表面3D融合蛋白能与口蹄疫病毒感染血清发生特异性反应[25]。

1.4 T7噬菌体展示系统

T7噬菌体的衣壳蛋白由主要头蛋白P10A、次要头蛋白P10B、颈圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17构成,其中P10A与P10B为主要衣壳蛋白。外源多肽或蛋白质一般插入到P10B的C端[26]。跟前面几种展示系统相比,T7噬菌体展示系统最大的优点为它能以高拷贝量展示含50个氨基酸残基的多肽片段和以低拷贝量或以中拷贝量展示含1200个氨基酸残基的外源多肽或蛋白质。此外,它还具有生长迅速、性质稳定、无辅助噬菌体进行包装等特殊性质[27]。因T7噬菌体作为展示载体的诸多优势,已广泛用于蛋白质的研究中。目前,应用 T7噬菌体展示工具可通过单循环高效的亲和选择结合蛋白或特异性多肽[28]。T7噬菌体展示技术系统目前有NOVAGEN公司生产的T7 Select@System系列试剂盒。

2 噬菌体展示技术在食物过敏原表位的应用

表位分析可用来研究抗原与抗体的反应机理、抗原分子的结构和功能,同时也可为药物筛选、多肽疫苗的研制和特异血清型的诊断方法提供重要线索和理论依据。过敏原表位的确认和定位是开展过敏症免疫干预治疗的基础。近年来,噬菌体展示这一技术广泛用于牛乳、鸡蛋、小麦、花生、大豆、鱼类、坚果类和甲壳纲动物这八大类主要食物过敏原[29]的研究及模拟表位肽筛选。

在抗原抗体的识别研究中,噬菌体随机肽库可直接筛选出与抗体结合的模拟表位。相比传统的抗原表位定位,应用酶切降解抗原分为无数段小片段或者合成一系列长短不一但能与抗原分子的某一段区域有相同序列的小肽段来与单抗结合,噬菌体展示技术既廉价又快速,并且在很大程度上简化了这一过程。

2.1 牛乳及牛乳制品

牛乳及牛乳制品因其含有较高的营养价值而受到广大消费者的青睐,但同时,牛乳及牛乳制品又是常见的八大食物过敏原之一[30]。牛乳中有30多种蛋白,都有潜在的致敏性,其中酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白为牛乳中的最主要过敏原。1997年Hunt等采用噬菌体展示技术定位到2个IgG线性结合表位区[31]。李欣等以兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗体IgG为固相筛选分子,免疫筛选噬菌体随机七肽库,确定了6个与兔血清IgG结合的水牛乳β-乳球蛋白线性表位[32]；2008年该课题组又通过淘选噬菌体环七肽库,定位出水牛乳β-乳球蛋白的2个构象型表位[33]。文学方通过噬菌体随机七肽筛选,得到5个牛乳α-乳白蛋白与兔IgG结合的线性表位区和2个构象型表位区[34]。因此,通过噬菌体展示技术获得了部分牛乳过敏原的构象性表位的信息。

2.2 鸡蛋

鸡蛋含有丰富的蛋白质、维生素及矿物质等营养物质,因为鸡蛋中的蛋清蛋白质氨基酸模式与合成人体组织蛋白氨基酸模式最为接近,而且吸收利用率也在99.6%以上,所以说鸡蛋是最为理想的食物蛋白质之一[35]。鸡蛋的过敏原蛋白主要存在于蛋清当中,蛋清含有超过24种不同的蛋白质,其中卵类黏蛋白(OVM或Gal d1)、卵白蛋白(OVA或Gald2)、卵转铁蛋白(OVT或Gal d3)和溶菌酶(Lys或Gal d4)为主要的过敏原[36]。佟平等以纯化的特异性兔IgG抗体为靶分子,用噬菌体随机七肽库对其进行亲和淘选,再对淘选到的274个阳性克隆子进行测序以及Clustalx序列比对,最终筛选到鸡蛋卵转铁蛋白IgG结合的17个主要线性模拟表位。其中14个可能的卵转铁蛋白IgE结合位点,3个可能的IgG结合位点,同时还预测到10个IgG和IgE共同结合位点[37]。目前,鸡蛋中其它过敏原采用该方法定位表位的研究工作未见报道,有待于进一步的探索。

2.3 小麦

小麦是主要的粮食作物之一,在粮食作物的世界总产量排名第二,仅次于玉米。对小麦的过敏反应在临床上表现主要有乳糜泻、面包师哮喘、特异性皮炎以及食物依赖运动激发过敏症[38]。其中在小麦的四种蛋白质中,清蛋白和球蛋白是面包师哮喘和小麦特异性皮炎过敏症中的最主要的过敏原[39-40]。Leticia等在研究小麦的Tria a 蛋白和桃子的Pru p 3蛋白的IgE结合位点时,用噬菌体展示文库对同一患者的总IgE进行筛选,并用纯化的抗原筛选阳性克隆,可以识别出Tria a 4和Pru p 3的模拟表位(构象性表位)。一个主要的构象模拟表位,L34H35N36R39S40S42D43G74V75L77P78Y79T80,它包括两个共同连续性表位,位于Tria a 4和一个与Pru p 3非常相似[41]。该研究说明噬菌体所展示的模拟表位可为一些交叉反应提供相似或相同的表位信息。

2.4 花生

花生为优质食用油的油料之一,因花生具有滋养补益、延年益寿的功效,所以民间又称其为“长生果”。但是花生也是主要的食物过敏原之一,并且对花生的过敏往往都是终生的,只有10%的过敏儿童会随年龄的增长产生免疫耐受[42]。花生含有11种过敏原蛋白,其中Ara h 1、Ara h 2被认为是主要的过敏原。Bogh等采用噬菌体展示技术来区分花生过敏原蛋白Ara h 1 IgE和IgG4的表位模式,得到了特异性和亲和性方面的重要信息。一般来说,IgG4的表位模式比IgE的表位模式更加多样化,IgG4的表位模式与IgE表位模式不一样,它的亲和力比IgE低。噬菌体展示随机肽库竞争免疫筛选是研究IgE和IgG4模拟表位的重要工具,对过敏原的表位信息提供了一种诊断工具[43]。Kleber等构建了容量为1011花生cDNA噬菌体展示文库。使用花生激发个体血清,含有低水平的花生提取物特异性IgE及花生过敏重症患者进行双重固化亲和筛选,经5轮淘洗和富集,筛选到IgE结合蛋白,其中有25个克隆表位序列即编码Ara h 5的氨基酸序列与公认的植物过敏原profiling的一致性较高,二者的相同率可达80%[44]。

2.5 大豆

同牛乳及牛乳制品一样,大豆也含有丰富的蛋白质及其他营养成分,它是自然界中最主要的植物蛋白资源之一。大豆中的过敏原蛋白分为种子储藏蛋白、结构蛋白和防御相关蛋白这三种,其中7S球蛋白组分中的Gly m Bd 30 K和Gly m Bd 28 K,β-伴大豆球蛋白中的Gly m Bd 60K是3种主要过敏原。应用噬菌体展示技术对大豆过敏原表位定位的研究还未见报道,不过对大豆过敏原表位的研究有较多报道。Helm等研究发现了Gly m Bd 30 K的5个主要的抗原表位分别被定于3～12、100～110、229～238、299～308和331～340位的IgE结合氨基酸残基上[45]。Dolly等研究发现了Gly m Bd 30 K5个主要的抗原表位分别被定于定位了Y260,D261,D262,K264和D266位的氨基酸残基上[46]。因噬菌体展示技术的种种优点,科研工作者日后将会使用该技术来对大豆过敏原模拟表位进行研究。

2.6 鱼类

鱼类富含蛋白质,产量高,是人类获取蛋白质的重要途径之一,但鱼类同时也是一种常见的过敏性食物,对鱼类过敏的患者一般不会随年龄的增长而消失。小清蛋白是鱼类的主要过敏原,这是一种分子量约为12ku的钙离子结合的水溶性酸性蛋白,主要存在于低等脊椎动物的肌肉中,对热稳定较好。Untersmayr等通过噬菌体环十肽库筛选,得到与鲤鱼小清蛋白的IgE和IgG特异性结合的鲤鱼主要过敏原蛋白5个构象性表位,其中1个构象性表位的氨基酸序列与已报道的鳕鱼小清蛋白的线性表位(AA33～44)结果一致[47]。

2.7 坚果类食物

坚果又称壳果,主要包括杏仁、腰果、榛子、核桃、松子、板栗、开心果等。坚果类食物营养价值很高,具有清除自由基、降低心脏性猝死率、调节血脂、补脑益智多种功效。有关坚果类过敏原的研究较少,主要集中在杏仁、腰果、榛子等方面。杏仁的主要过敏原是Pru du 1至 Pru du 4[48]；腰果的主要过敏原是Ana o 2[49]；榛子的主要过敏原是Cor h l[50]。Pacios等从十二肽库中淘选出桃子过敏原Pru p 3的构象性模拟肽,并以静电和溶剂排斥表面性为参数,确定了2个构象性表位[51]；在此基础上,2009年该课题组在研究Pru p 3和小麦中同源蛋白Tri a 14交叉反应时,发现两者存在一个共同的构象性表位[52]。

2.8 甲壳纲动物

甲壳类动物也是常见的八大食物过敏原之一,并且甲壳类过敏原的致敏性比鱼类过敏原的致敏性更强。原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)和精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)为甲壳类动物主要过敏原,原肌球蛋白相对分子质量约为36000,为盐溶性肌原纤维蛋白,在种间能够发生明显交叉反应。精氨酸激酶相对分子质量约为40000,它是调节无脊椎动物能量代谢的重要酶类之一[53-54]。Nitat等用噬菌体七肽库筛选来鉴定MAb38G6的模拟表位,由噬菌体七肽库克隆,用PCR技术扩增对MAb38G6高亲和力DNA,对个体的DNA进行扩增测序。在所有克隆中发现有相同的核苷酸序列:CTC ACT CCA TGC CGT AAT AAG,因此,该模拟表位肽序列是LTPCRNK,其中LTP是噬菌体的衣壳肽的氨基酸[55]。

噬菌体展示技术对八大食物过敏原以外的过敏原表位也有研究。Tordesillas等[56]以人IgE为靶分子,从十二肽库中筛选到过敏原Cuc m 2的1个构象性模拟肽,并利用3DEX软件确认此模拟肽对应的构象性表位是与过敏原Ph1 p12、Bet v 2存在交叉反应的物质基础。噬菌体展示技术还可以筛选出具有低免疫原性的碳水化合物和脂质类抗原的模拟表位[57-58]。模拟表位与载体蛋白结合或以一种聚合物的形式已经被开发用于癌症、抗过敏和避孕疫苗等领域[59-60]。

3 总结

自1990年Scott等首次建立噬菌体展示技术以来[14],噬菌体展示技术已发展成为一种强大的工具。除了在食物过敏表位定位的研究应用,噬菌体展示技术在蛋白质之间的相互作用、药物筛选和疫苗开发、筛选酶抑制剂等方面的研究也极为普及,涉及到免疫学、生物化学、蛋白质工程、细胞生物学等诸多领域。如Caberoy等人通过应用T7噬菌体展示的一种改进系统有效识别的肥胖结合蛋白,结果表明新设计的噬菌体展示系统是一种强大的技术,可以确定未知蛋白质与蛋白质之间的相互作用[61]。Shukla等通过建立快速筛选β-内酰氨酶配体的方法,筛选出了作为一种头孢菌素类药物前体的 β-内酰氨酶配体,在病毒导向酶解药物前体疗法治疗肿瘤方面具有比较好的效果[62]。Kristan 等通过研究噬菌体展示文库结合筛选出β-酮脂酰-ACP还原酶(FabG)的抑制剂[63]。

噬菌体展示技术给食物过敏原表位的研究提供了一个很好的展示平台,为开展对过敏症免疫干预治疗提供了理论基础。该技术在生命科学领域的研究以及应用已极为广泛,期望随着对噬菌体展示技术的不断完善,能够将它应用于更多的科学研究。

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Research progress in the phage display technology mapping epitopefor major food allergens

YUAN Shui-lin1,2,LI Xin1,2,*,CHEN Hong-bing1,3,GAO Jin-yan2,XIONG Ding1,2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China；2.School of Life Sciences and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Phage display technology is a screening technologyinvitro. Since the technique has achieved the unification of the gene and its corresponding proteininvitro,it has widely used in many fields such as life sciences,medication and so on. At present,the main phage display systems include filamentous phage display system,λ phage display system,T4 phage display system and T7 phage display system. The phage display technology and its application in identifying of eight categories food antigenic epitopes was reviewed in this paper.

phage display technology;phage display system;food allergy;epitope;application

2014-04-08

袁水林(1989-),男,硕士研究生,研究方向：食品科学与工程。

*通讯作者:李欣(1980-),女,博士,副教授,研究方向：食品生物技术。

国家“863”计划项目(2013AA102205)；国家自然科学基金(31260204,31301522)；国家科技支撑计划项目(2012BAK17B02)；江西省自然科学基金(2012BAB204002)；江西省教育厅课题(GJJ12143)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)03-0379-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.074