水产品中孔雀石绿及其代谢产物残留检测方法研究进展

李秀霞,李 娇,孙协军,冯彦博,季晓琳,李 爽,励建荣

(渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”,辽宁锦州 121013)

水产品中孔雀石绿及其代谢产物残留检测方法研究进展

李秀霞,李 娇,孙协军,冯彦博,季晓琳,李 爽,励建荣*

(渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”,辽宁锦州 121013)

孔雀石绿(MG)是一种禁止用于水产养殖的三苯甲烷类药物。该药物杀菌效果好但具有“三致”危害,残留在水产品中会损害人体健康。本文综述了水产品中孔雀石绿及其代谢产物残留的检测方法的研究进展,可以为新方法的建立或采用提供参考。

水产品,孔雀石绿,样品前处理,检测方法

孔雀石绿(Malachite green,MG；化学名称:四甲基代二氨基三苯甲烷；分子式:C23H25ClN2)(分子结构见图1)属三苯甲烷类染料,又称碱性孔雀(石)绿、碱性绿、品绿、盐基块绿、苯胺绿等,是具有金属光泽的绿色结晶状固体[1],易溶于水和乙醇,水溶液呈蓝绿色。在工业上,曾经作为染料被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品染色剂和细胞化学染色剂[2]；在水产养殖业上,作为杀菌剂用于预防和治疗各类水产生物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等,其中治疗鱼卵和鱼体的水霉病的效果较好,鱼类在打捞过程中,鱼体易受伤而被真菌感染,孔雀石绿可有效控制真菌。孔雀石绿化学性质不稳定,多以草酸盐的形式存在,孔雀石绿进入动物机体后,通过生物转化,被还原成脂溶性的无色孔雀石绿,并在组织中蓄积[3],具有高毒性、高残留和致畸、致癌、致突变的危害[1]。孔雀石绿在鱼体内可代谢为无色孔雀石绿(Leucomalachite green,LMG；分子式:C23H26N2)(分子结构见图1),无色孔雀石绿也叫隐性孔雀石绿,结构式中连接三个苯基的碳是单键,性质较孔雀石绿稳定,但毒性更强。鉴于孔雀石绿及其代谢产物-无色孔雀石绿的危害,美国以及欧盟许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物[4],我国也于2002年5月将其列为水产养殖中的禁用药物(农业部公告193号)[5],但由于孔雀石绿杀菌效果较好并且价格低廉,个别养殖户仍在使用,造成水产品或养殖水体中仍旧被检出有痕量的孔雀石绿残留。

近年来,水产品中孔雀石绿被检出的事件也时有发生,为有效保证水产品的质量安全,对水产品中孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿残留的检测方法的研究是必要的。本文从样品前处理方法和孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿残留的检测方法两方面进行阐述,可以为新方法的建立或采用提供参考。

图1 孔雀石绿和无色孔雀石绿的结构式Fig.1 The structure of MG and LMG

1 前处理方法

水产品中MG以及LMG的前处理方法主要分两步:第一步是使用乙腈及其他溶剂提取,第二步是用固相萃取柱(SPE)净化[6]。

1.1 样品制备和提取

目前,人工养殖鱼类中可能被添加孔雀石绿[7],无色孔雀石绿在水产品组织中累积,它的去除很大程度上依赖于脂肪的含量的变化[8]。

我国国家标准GB/T20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》[9]在样品前处理过程中加入硼氢化钾,将水产品中残留的孔雀石绿全部还原成隐性孔雀石绿,再采用荧光检测器进行定量检测。此方法的检出限及回收率均较好,但样品前处理过程需要经过溶剂反复萃取、离心、震荡、固相萃取、干燥等多个步骤,过程繁琐,导致孔雀石绿回收率不稳定。

因此,国内许多学者对于孔雀石绿的提取及净化方法进行了改进:吴桂玲[10]等在样品前处理过程中省略了二氯甲烷萃取步骤,并采用氮气吹干法替代了旋转蒸发步骤,其中孔雀石绿的加标回收率在88%～94%之间。杨贤庆[11]等对国标GB/T20361-2006孔雀石绿提取方法进行了简化,提取过程中即加入乙酸铵溶液,控制pH4.5,同时加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺,然后再加入酸性氧化铝。采用该方法对罗非鱼、对虾和鳗鲡三种水产品的测定结果显示,回收率为80.7%～109.8%。

1.2 样品净化和富集

由于鱼肉组织中富含蛋白质,脂肪等,提取基质中杂质干扰很多,需要对样品进行净化处理,多用二氯甲烷对其反复萃取,罗瑞峰[12]等人发现二氯甲烷萃取过程中容易出现分层不稳定的问题,有时二氯甲烷层会出现分层不明显或二氯甲烷层忽上忽下的情况。因此,对净化方法进行了改进,在分液漏斗中加入饱和氯化钠溶液,由于盐析作用,使弱极性的LMG更易转入有机相而易分层,该方法的加标回收率在78.3%～100.9%。

在样品的富集方面,大多数学者选用中性或酸性氧化铝固相萃取柱串联丙磺酸阳离子固相萃取柱(PRS)。宫向红[13]等人比较了混合型阳离子交换固相萃取小柱(MCX)、混合型弱阳离子交换反相固相萃取柱(WCX)以及混合型反相阳离子交换固相萃取小柱(MCAX)的回收率,发现WCX对MG及LMG的保留性太差,淋洗过程中有损失。而MCAX的保留性较好、容易洗脱、回收率在90%～95%。窦红[14]选用柱色谱用的硅胶填充固相萃取柱,效果也良好,孔雀石绿及代谢物的检出限分别为2g/kg和4g/kg,加标回收率为70%～95%。

2 检测方法

水产品中孔雀石绿及其代谢产物的检测方法主要有高效液相色谱法[15]、高效液相色谱质谱法[16]、酶联免疫吸附法[17]等,其中以高效液相色谱法最为常用。

2.1 高效液相色谱法

目前,高效液相色谱检测法主要有高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-Vis)、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-Fld)还有高效液相色谱-紫外荧光检测法。无论紫外还是荧光检测,这两种技术均满足食品药品监督管理局(FDA)以及欧共体(EC)规定的灵敏度要求[18]。

2.1.1 高效液相色谱紫外检测法 孔雀石绿在水产品体内可被代谢为无色孔雀石绿,所以鱼体内同时残留孔雀石绿以及无色孔雀石绿。孔雀石绿肉眼可见,水溶液显蓝绿色,可被可见光分光光度计或者高效液相色谱的紫外光检测器测定(检测波长618nm)。

我国国家标准GB/T19857-2005[16]是利用柱后衍生法,在液相色谱柱和紫外-可见光检测器之间接上填充二氧化铅的衍生柱,目的是将无色孔雀石绿衍生成孔雀石绿。

Lee[19]等采用LC-Vis在波长618nm和588nm下同时检测水产品中孔雀石绿和结晶紫的残留,并且通过LC-ESI-MS/MS的方法进行定性,证实了两者就是所要检测目标,其中MG和LMG的回收率分别为74.8%～83.8%和80.0%～88.4%。张彤晴[20]等采用二氯甲烷混合溶剂萃取、离心分离及旋转蒸发浓缩的方法提取净化水中孔雀石绿(MG)和隐性孔雀石绿(LMG),HPLC-Vis检测,回收率在83%～93.5%之间。国外对于孔雀石绿的研究主要集中于其毒理药理作用及清除方法,而检测方法方面研究报道相对较少,Wu等[21]对鲶鱼和鳟鱼LMG和MG残留进行了分析,采用二氯甲烷液液萃取后,碱性氧化铝柱和MCX柱净化,HPLC-Vis检测,LMG采用PbO2柱后氧化衍生,此方法的鲶鱼LMG和MG加标回收率分别在75.4%和61.3%,鳟鱼中LMG和MG回收率分别在82.6%和48.6%。Long[22]等采用一种新型的氧化柱对LMG采用柱后衍生,二氯甲烷液液萃取,中性氧化铝净化,得到MG、LMG的回收率分别为67.3%～73.9%和84.7%～92.1%。

2.1.2 高效液相色谱荧光检测法 无色孔雀石绿肉眼不可见,水溶液显无色,但是无色孔雀石绿具有荧光特性,因此可用荧光分光光度计或者高效液相色谱的荧光检测器测定(激发波长265nm；发射波长360nm)。国标GB/T20361-2006[23]是在样品前处理过程中加入硼氢化钾,将孔雀石绿还原成无色孔雀石绿,再通过荧光检测器进行测定。

王静[24]等人在上述国标的基础上探讨了硼氢化钾浓度的选择以及孔雀石绿的转化率问题。经实验证明:0.2mol/L硼氢化钾溶液3mL可以保证孔雀石绿转化为无色孔雀石绿的转化率在99.1%～100.8%。万译文[25]等人用流动相乙腈和乙酸铵缓冲液、乙腈反复提取,最后用二氯甲烷反萃取,采用PRS柱上接中性氧化铝柱净化,硼氢化钾还原,反向柱色谱分离,使用高效液相色谱荧光检测器检测。方法操作简单、灵敏度高,加标回收率在75.1%～95.1%,相对标准偏差3.7%～7.1%,检出限均为0.5μg/kg。周蓉[26]等人根据GB/T19857-2005(水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定)、SC/T3021-2004(水产品中孔雀石绿残留量的测定,液相色谱法)和GB/T20361-2006(水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定,高效液相色谱荧光检测法),利用高效液相色谱对孔雀石绿的检测方法进行优化:采用氰基柱分离、改变流动相比例、减少流速和梯度洗脱等方式,使孔雀石绿的最低检测达到5μg/mL；隐性孔雀石绿达到2μg/mL。

2.1.3 高效液相色谱紫外和荧光检测器同时检测法 针对实际操作中可能会出现孔雀石绿不易完全被硼氢化钾还原为无色孔雀石绿的情况,可以将紫外检测器和荧光检测器串联起来使用,这样无色孔雀石绿可以用荧光检测器检测；没有被还原的孔雀石绿可以被紫外检测器检测出来,最后将两者一起定量。

桂英爱[27]等人采用乙腈/二氯甲烷(1∶1,v/v)萃取和35～40℃旋转蒸发的方法提取及净化水样中孔雀石绿和隐性孔雀石绿,采用紫外和荧光检测器同时检测,该方法的两种物质的加标回收率分别为95.2%和92.3%,最低检测限1.1ug/kg,检测方法稳定,简便,灵敏度高,无需柱后氧化。

2.2 高效液相色谱质谱法

欧共体(EC)在2002年的657号委员会决议指示,孔雀石绿、无色孔雀石绿、结晶紫和亮绿这四个鉴定点需要获得可靠的物质鉴定[28],因此,高效液相色谱串联质谱联用技术逐渐应用于水产品孔雀石绿残留的分析中。该方法取替高效液相色谱的紫外或者荧光检测器,使用离子阱质谱或者三重四级杆质谱作为检测器,增强了对化合物的结构鉴定能力,同时也保留了高效液相色谱的检出限低、灵敏度高等特点。然而高效液相色谱-质谱联用仪昂贵的价格限制了该方法在一般实验室以及科研质检单位的普及。

国标GB/T19857-2005[16]将待测样品用乙腈—乙酸铵缓冲溶液提取,再用乙腈提取后,液液分配到二氯甲烷层,经中性氧化铝柱和PRS柱净化后经液相色谱串联质谱法测定,内标法定量。方法检出限0.5μg/kg。Juliana[29]等人对QuEChERS技术[Quick(快速),Easy(简易),Cheap(廉价),Effective(有效),Rugged(稳定),Safe(安全)的萃取方法]进行改良,用乙腈和pH3～pH5的水溶液进行提取,SPE法进行净化,待测样品最后运用LC-MS/MS检测。该方法最低检测限2ng/g,准确度95%～107%。兆善贞[30]等人提出了高效液相色谱-四级杆串联线性离子阱质谱法测定水产中的孔雀石绿及其代谢物的方法。内标法定量,四极杆串联线性离子阱质谱进行检测。检出限为0.5μg/kg。回收率在93.3%～120%之间,还采用数据相关采集模式结合增强离子扫描模式对化合物进行定性分析,能够在定量同时进行定性确证。谢世红[31]等用乙腈提取样品后,用中性氧化铝柱净化,采用液相色谱-串联质谱进行测定。最低检出限为0.5μg/kg,加标回收率为80%～110%,符合国标要求,该方法也可以同时测定氯霉素残留。

2.3 酶联免疫吸附法

酶联免疫法是一种免疫学检测方法,该方法具有特异性和敏感性。王权[32]等人采用抗无色孔雀石绿单克隆抗体建立了水产品中孔雀石绿残留的间接竞争ELISA检测方法。结果表明,LMG-McAb最佳稀释倍数为1∶80000,包被抗原最佳质量浓度为0.80μg/mL；竞争反应时的LMG理想稀释液为40%乙腈水溶液；最低检测限为1.29ng/mL,鳗鱼肉样的平均加标回收率为90%～110%；该方法与其他抗生素无交叉反应。利用酶联免疫试剂盒测定水产品中孔雀石绿残留的特点是速度快,灵敏度高,适合筛选大批量样品,但此种方法的缺点是只能测定孔雀石绿残留的总量而且测定结果的假阳性几率高。

2.4 其他检测方法

对于水产品中孔雀石绿残留的其他检测方法还有气相色谱质谱联用法[6]、分光光度法[33]、薄层色谱法[34-35]等。Nebot[6]等采用超声波辅助提取和二氯甲烷萃取的方法,应用Aglient1100气质联用仪对几种鱼的孔雀石绿及其代谢产物进行了分析,各种被检样品中MG的加标回收率都在70%以上,检出限2μg/kg。分光光度法和薄层层析法比较适用于被检测样品中目标化合物含量较高的情况,多被用于从本体中大量提取某种有效成分并对其分离、纯化和鉴定等。而对于水产品中检测微量甚至痕量的孔雀石绿,容易受到基质中其他杂质的影响而存在灵敏度低、定性结果常出现假阳性；定量结果误差范围大的缺点。

3 展望

目前,随着我国水产养殖业的不断壮大,消费者对于水产品的需求越来越大,水产品安全问题不容被忽视。水产品中孔雀石绿及其代谢产物残留可能对消费者的健康甚至我国水产品的进出口贸易造成影响。所以孔雀石绿及其代谢产物残留的检测方法的研究具有重要意义。高效液相色谱法能够对目标检测物进行有效分离,具有灵敏度高,检出限低等优点；高效液相色谱质谱法虽然具有强大的化合物结构鉴定能力,但由于成本较高,不适合一般科研实验室及企业化验室；酶联免疫法有特异性和敏感性的优点,酶联免疫试剂盒检测速度快,适合大批量检测,但易受环境条件影响而出现假阳性结果,对检测的定性判断造成干扰；其他检测方法像分光光度法以及薄层色谱法因其灵敏度低、检测结果误差范围大,不适合于微量孔雀石绿的检测。综上所述,今后我国水产品中孔雀石绿及其代谢产物残留的检测方法研究可以采用高效液相色谱法,建立简单有效、自动化程度高的前处理方法,减化样品前处理中提取和净化步骤,提高检测结果的准确性、降低检测方法的检出限。

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Research progress in detection methods of malachite green andits metabolites residues in aquatic products

LI Xiu-xia,LI Jiao,SUN Xie-jun,FENG Yan-bo,JI Xiao-lin,LI Shuang,LI Jian-rong*

(College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Food Safety Key Lab ofLiaoning Province,Engineering and Technology Research Center of Food Preservation,Processing and Safety Control of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

Malachite green(MG)belongs to Triphenylmethane,which has been banned in aquiculture. It is a broad-spectrum fungicide,but the residues of MG and its metabolites in aquatic products are very harmful to human health because of their carcinogenesis,mutagenesis and teratogenecity. In this article,the recent detecting methods development of MG and its metabolites residues in aquatic products were summarized,which provided the reference for the establishment and use of new method.

aquatic products;malachite green;sample pretreatment;detection methods

2014-05-14

李秀霞(1973-)，女，博士，副教授，主要从事水产品贮藏加工的研究。

*通讯作者:励建荣(1964-)，男，博士，教授，主要从事水产品和果蔬贮藏加工及质量安全控制方面的研究。

“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD29B06)；辽宁省食品安全重点实验室开放课题(LNSAKF2011015)。

TS219

A

1002-0306(2015)03-0385-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.075