BMP4增强结直肠癌耐药细胞化疗敏感性的作用及机制＊

颜 畅， 胡艺冰， 穆 磊， 黄开禹， 覃吉超△

BMP4增强结直肠癌耐药细胞化疗敏感性的作用及机制＊

颜 畅1， 胡艺冰2， 穆 磊1， 黄开禹1， 覃吉超1△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1分子医学中心2甲乳外科，武汉 430030

目的 研究骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）对结直肠癌耐药细胞化疗敏感性的影响及机制。方法 采用5-氟尿嘧啶（5-Fu）处理结直肠癌细胞株LoVo，建立耐药细胞株LoVo／5-Fu；通过CCK-8法检测LoVo／5-Fu细胞和亲本细胞对5-Fu、奥沙利铂或伊立替康的敏感性，并检测不同浓度BMP4对LoVo／5-Fu细胞生长的抑制效应；用5-Fu联合BMP4处理LoVo／5-Fu细胞3d，采用Annexin-Ⅴ／PI法检测5-Fu联合BMP4处理后LoVo／5-Fu细胞的凋亡情况；通过裸鼠体内成瘤实验观察BMP4在体内对LoVo／5-Fu细胞化疗敏感性的影响；采用Western blot检测BMP4处理后LoVo／5-Fu细胞中AKT信号通路活性和Bcl-2的蛋白水平。结果 5-Fu诱导形成的耐药细胞株LoVo／5-Fu可以在含5μg／mL 5-Fu的培养液中稳定生长，并对奥沙利铂和伊立替康有交叉耐药；BMP4可以抑制LoVo／5-Fu细胞的生长，抑制效应呈时间和浓度依赖性；细胞凋亡实验显示BMP4可以促进培养在含5μg／mL 5-Fu培养液中的LoVo／5-Fu细胞发生凋亡；裸鼠体内成瘤实验显示BMP4可以有效增强LoVo／5-Fu细胞在体内的对5-Fu的敏感性，抑制其在裸鼠体内的生长；Western blot检测发现BMP4可以抑制LoVo／5-Fu细胞中AKT的磷酸化，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论 BMP4可以增强结直肠癌耐药细胞对化疗的敏感性；其机制有可能是通过抑制细胞中AKT通路的活性和Bcl-2表达，降低细胞抵抗凋亡的能力。

骨形态发生蛋白4； 结直肠癌； 多药耐药； 化疗敏感性； 细胞凋亡

2015年公布的世界癌症数据显示，在2012年中结直肠癌的新发病例为1 400万，仍是世界发病率前三的肿瘤［1］。在过去的几十年中，由于肿瘤研究的深入和外科治疗的发展，结直肠癌的诊断和治疗得到了长足的发展，但是，仍有相当一部分患者在治疗过程中由于肿瘤细胞产生多药耐药性（multidrug-resistance，MDR）导致治疗失败。

MDR的发生与多种因素有关，如多发性耐药蛋白（multidrug resistance protein 1，MDR1）、人腺苷三磷酸结合盒转运体G2（ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）、Bcl-2等。而MDR形成的机制和解决方式是当前化疗中亟须研究和解决的难题。通过调节这些基因或蛋白表达，可以增强这些耐药细胞的化疗敏感性，改善患者预后。

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），除BMP1外其余均属于转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族，其中BMP4可以抑制肿瘤生长［2］。近期更有少量研究发现，BMP4可以促进肿瘤干细胞分化为分化细胞［3］。而现在的研究证明肿瘤干细胞具有自发性耐药的特征，在肿瘤耐药中也具有重要的作用［4］。因此，我们猜想，BMP4或许可以增强具有MDR特性的细胞对化疗的敏感性，并在本研究探索了BMP4对化疗耐药的结直肠癌细胞的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

结直肠癌细胞株LoVo来源于本实验室。实验动物为4周龄雌性裸鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，于华中科技大学同济医学院实验动物学部SPF级动物中心饲养。BMP4、5-Fu、奥沙利铂、伊立替康和二甲基亚砜均购自美国Sigma公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司，细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展公司，基质胶购于美国BD公司，小鼠抗人GAPDH、AKT、磷酸化AKT（pAKT）和Bcl-2抗体购自美国CST公司。

1.2 细胞培养和耐药细胞系的建立

LoVo细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，并置于37℃、5%CO2培养箱中。采用含5-Fu的培养液持续处理LoVo细胞，5-Fu浓度从0.5μg／mL逐渐递增，持续培养12周后，可见细胞在5-Fu浓度为5μg／mL的培养液中稳定生长。

1.3 细胞活性或数目测定

取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配置成细胞密度为30 000／mL的单细胞悬液，接种到96孔板（3 000个细胞／孔），培养12h后，加入不同浓度或不同类型的药物，并设置4个复孔和阴性对照。持续药物作用72h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃，5%CO2培养箱培养1h后，用台式酶标仪于450nm处检测吸光度值。计算IC50，即细胞数量为对照组细胞数量50%时的药物浓度，耐药倍数（RI）＝耐药细胞IC50／亲本细胞IC50。

1.4 细胞凋亡检测

取50 000个LoVo／5-Fu细胞接种于6孔板内，培养于含5μg／mL 5-Fu的培养液中。待细胞贴壁后，加入100ng／mL BMP4或对照，持续培养3 d后收集细胞，根据细胞凋亡试剂盒说明书，用Annexin-Ⅴ（FITC）和碘化丙啶（PI）标记细胞，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率。

1.5 Western blot检测

用NP40溶液裂解细胞获得总蛋白样品，行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），PVDF膜转膜并以脱脂牛奶封闭非特异性结合，然后依次孵育一抗及抗小鼠二抗，用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。最后，用ECL显色液曝光显影，凝胶分析系统分析蛋白表达。

1.6 动物实验

收集对数生长期细胞，用PBS溶液重悬至20 000／mL，与基质胶1∶1混匀后，注射至裸鼠两侧背部（100μL／注射点）。每3天小鼠经腹腔注射5-Fu（100mg／kg），待形成肿瘤后，每3天经瘤内注射100ng BMP4并观察和记录肿瘤体积（肿瘤体积＝长径2×短径／2）。接种35d后收获肿瘤并称量肿瘤重量。

1.7 统计学方法应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，实验数据用¯x±s表示。组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LoVo／5-Fu细胞株的建立

采用药物浓度梯度递增的方法，LoVo细胞经过5-Fu持续处理12周后，可在5-Fu浓度为5μg／mL的培养液中稳定生长，即成功建立耐药细胞株LoVo／5-Fu。通过应用浓度梯度递增的化疗药物处理LoVo／5-Fu细胞和亲本细胞，检测不同药物IC50，发现LoVo／5-Fu细胞不仅对5-Fu耐药，对结直肠癌常规化疗药物奥沙利铂和伊立替康也具有交叉耐药，5-Fu、奥沙利铂、伊立替康的RI分别为8.57、6.24、2.16。结果提示，LoVo／5-Fu细胞有多药耐药（MDR）的特性。

2.2 BMP4对LoVo／5-Fu细胞的生长抑制作用及化疗增敏作用

通过用不同浓度的BMP4处理LoVo／5-Fu细胞，结果显示，BMP4对LoVo／5-Fu细胞生长的抑制效应呈时间和浓度依赖性，在BMP4浓度为100 ng／mL时效应最为显著（图1）；在培养于含5μg／mL 5-Fu培养液的LoVo／5-Fu细胞中加入100 ng／mL BMP4，结果显示，LoVo／5-Fu细胞在5-Fu浓度为5μg／mL的培养液中未见明显凋亡，加入BMP4后细胞发生凋亡（图2）；在裸鼠背部接种LoVo／5-Fu细胞，并用5-Fu维持化疗，发现BMP4治疗组的肿瘤生长速度和肿瘤重量均低于对照组，差异均有统计学意义（图3）。以上结果提示，BMP4可以抑制结直肠癌耐药细胞的增殖，并在体内和体外均可以增强结直肠癌耐药细胞对化疗的敏感性。

图1 BMP4对LoVo／5-Fu细胞的生长抑制作用Fig.1 Growth inhibitory effect of BMP4on LoVo／5-Fu cells

图2 流式细胞仪检测BMP4处理后LoVo／5-Fu细胞的凋亡Fig.2 Flow cytometry analysis of the apoptosis of LoVo／5－Fu cells treated by BMP4

2.3 BMP4增强LoVo／5-Fu细胞化疗敏感性的机制

用100ng／mL BMP4处理LoVo／5-Fu细胞3d后，提取细胞总蛋白，Western blot检测显示，BMP4处理后LoVo／5-Fu细胞中的pAKT和Bcl-2的表达降低（图4）。结果提示，BMP4可以抑制AKT信号通路和Bcl-2的表达，抑制细胞的抗凋亡能力。

图3 BMP4处理后小鼠体内的肿瘤生长曲线和重量Fig.3 Growth curves and weights of xenograft tumors in micetreated with BMP4

图4 Western blot检测BMP4对LoVo／5-Fu细胞中AKT信号通路和Bcl-2的影响Fig.4 Western blot analysis of the effect of BMP4on the AKT pathway and Bcl-2expression in LoVo／5-Fu cells

3 讨论

化疗是结直肠癌综合治疗的重要部分。到目前为止，如何提高化疗疗效以及降低肿瘤的耐药能力是许多研究的热点。本研究通过5-Fu诱导形成多药耐药的结直肠癌细胞，采用BMP4处理耐药细胞，发现BMP4在体外可以抑制耐药细胞的增殖，并增强细胞对5-Fu的敏感性。我们在动物体内的研究发现，用BMP4处理5-Fu维持化疗的小鼠可明显观察到其抑制肿瘤的生长。

BMP4是TGF-β超家族中的一员，它可以激活TGF-β／Smad信号通路，也可以通过其他非经典通路影响PI3K／AKT和Wnt信号通路活性［5］。我们的结果显示，BMP4可以抑制AKT的磷酸化，从而抑制PI3K／AKT信号通路。而PI3K／AKT信号通路是调控肿瘤增殖和凋亡的重要信号通路，它可以通过多种途径抑制细胞凋亡，如磷酸化BAD（Bcl-2-associated death promoter）蛋白或Par-4（Prostate apoptosis response-4）蛋白，抑制其促进凋亡的功能；激活NF-κB信号通路增强Bcl-2家族成员的表达［6］。同时，我们也发现了BMP4处理后细胞Bcl-2的表达也明显降低。

目前的观点认为，药物的联合治疗可以提高结直肠癌的生存，改善患者预后［7］。并且也有研究发现，BMP4可以促进肿瘤干细胞分化为非肿瘤干细胞细胞，从而增强化疗药物对肿瘤干细胞的杀伤能力［8］。总的来说，本研究证实了BMP4可以增强结直肠癌耐药细胞对化疗的敏感性，其机制有可能是通过抑制PI3K／AKT信号通路和Bcl-2的表达。提示，BMP4有可能作为新的药物应用于临床，增强化疗药物的作用，改善患者的预后。

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［5］ He X C，Zhang J，Tong W G，et al.BMP signaling inhibits intestinal stem cell self-renewal through suppression of Wnt-beta-catenin signaling［J］.Nat Genet，2004，36（10）:1117-1121.

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（2015-02-27 收稿）

BMP4 Enhances the Chemosensitivity of Drug-resistant Colorectal Cancer Cells

Yan Chang1，Hu Yibing2，Mu Lei1et al
1Molecular Medicine Center／Department of General Surgery，2Department of Thyroid and Breast Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the influence of bone morphogenetic protein 4（BMP4）on the chemosensitivity of drugresistant colorectal cancer cells.Methods Human drug-resistant colon cancer cell line，LoVo／5-Fu，was established by continuous exposure to 5-Fu.CCK-8assay was used to evaluate the chemosensitivity of drug-resistant and parent cells to 5-Fu，oxaliplatin or irinotecan，and the growth inhibitory effect of gradient concentrations of BMP4on LoVo／5-Fu cells.Annexin V／PI assay was employed to detect the apoptosis of LoVo／5-Fu cells treated with BMP4and 5-Fu for 3days.Tumorigenicity assay was used to investigate the effect of BMP4on chemosensitivity of LoVo／5-Fu cells in vivo.Western blot was performed to detect the activity of AKT pathway and the expression of Bcl-2.Results LoVo／5-Fu cells could stably grow in the culture medium containing 5μg／mL 5-Fu，and showed a cross resistance to oxaliplatin and irinotecan.CCK-8assay revealed that BMP4inhibited cell proliferation in a concentration-and time-dependent manner.Moreover，BMP4could induce the apoptosis of LoVo／5-Fu cells treated by 5μg／mL 5-Fu.It enhanced chemotherapeutic sensitivity of LoVo／5-Fu cells in vivo and suppressed tumor growth.Western blot revealed that BMP4inhibited the activity of AKT pathway and the expression of Bcl-2.Conclusion BMP4 enhances the chemosensitivity of drug-resistant colorectal cancer cells possibly by inhibiting the activity AKT pathway and the expression of Bcl-2and reducing the ability of cells against apoptosis.

bone morphogenetic protein 4（BMP4）； colorectal cancer； multidrug resistance； chemosensitivity； apoptosis

R735.3

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.008

＊国家自然科学基金资助项目（No.81172065）

颜 畅，男，1989年生，博士研究生，E－mail:yanchangforever＠163.com△

，Corresponding author，E-mail:jcqin＠tjh.tjmu.edu.cn