缺血缺氧中心区星形胶质细胞死亡方式与钠钾ATP酶活性及NKCC1表达的关系＊

卢 艺， 褚晓凡， 黄巧英， 曹 旭， 邹良玉， 张 莹

缺血缺氧中心区星形胶质细胞死亡方式与钠钾ATP酶活性及NKCC1表达的关系＊

卢 艺， 褚晓凡， 黄巧英， 曹 旭， 邹良玉， 张 莹

深圳市人民医院神经内科，深圳 518000

目的 通过改良的糖氧剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）模型，探讨缺血缺氧中心区星形胶质细胞损伤后的细胞死亡途径与细胞膜损伤中钠钾ATP酶（Na＋-K＋-ATPase）活性及钠-钾-氯共转运体1（Na＋-K＋-2Cl－-cotransporter 1，NKCC1）表达的关系。方法 取出生24h内的SD大鼠海马星形胶质细胞进行体外培养，鉴定其纯度，应用改良的OGD模型，将星形胶质细胞进行OGD（0、1、2、3、4、6h）处理后检测不同时间点细胞的胀亡率、凋亡率、ATP含量、钠钾ATP酶的活性及NKCC1的表达水平。结果 星形胶质细胞存活率随OGD时间的延长而降低，OGD 3h后胀亡细胞率超过凋亡细胞率。ATP含量和钠钾ATP酶活性随OGD时间的延长而下降，NKCC1的表达随着OGD时间的延长先增加后减少，在OGD 3h后明显减少。结论 缺血缺氧中心区星形胶质细胞死亡在OGD 3h内以凋亡为主，OGD 3h后胀亡是细胞死亡的主要方式，这种转化或许与Na＋，K＋-ATPase活性及NKCC1表达的激活有关。

星形胶质细胞； 糖氧剥夺模型； 胀亡； 钠钾ATP酶； 钠-钾-氯共转运体1

星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞，它们向神经元提供营养支持和代谢底物，调节突触活性，维持神经元的功能［1］。作为中枢神经系统的主要组成成分之一，星形胶质细胞的死亡方式也逐渐被重视，其死亡方式包括凋亡、胀亡、自噬性细胞死亡等模式，不同的死亡信号途径可以促发不同的细胞死亡方式。本课题组前期研究表明，应用改良的糖氧剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）模型能模拟缺血缺氧中心区星形胶质细胞损伤，同时缺血缺氧中心区的星形胶质细胞可经由凋亡及胀亡两种途径走向死亡，而不同缺血缺氧时期其主要的死亡方式亦有所不同［23］。本实验则从细胞膜离子泵功能及钠-钾-氯共转运体1（Na＋-K＋-2Cl－-cotransporter 1，NKCC1）表达变化的角度，通过应用改良的模拟缺血缺氧中心区星形胶质细胞损伤的糖氧剥夺模型，探讨缺血缺氧中心区星形胶质细胞在糖氧剥夺后细胞死亡与细胞膜损伤中的ATP含量、钠钾ATP酶（Na＋-K＋-ATPase）活性及NKCC1表达的关系。

1 材料与方法

1.1 星形胶质细胞原代培养

无菌条件下取出生24h内Sprague-Dawley大鼠（广东省实验动物中心）大脑海马，剪碎、吹打、过滤，用含10%胎牛血清＋10%小牛血清＋青／链双抗的DMEM培养液调整细胞密度为l×106个／mL，接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱培养。24h后换液，以后每3天更换培养液1次。传代纯化培养，直至传代到第3代。第3代星形胶质细胞行胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）鉴定，细胞纯度达95%以上时用于后续实验。一般原代细胞培养至第3代需18～21 d，此时正是星形胶质细胞缺血缺氧条件下生长曲线的高峰敏感期，因此后续实验均使用该期细胞［4］。

1.2 GFAP染色鉴定星形胶质细胞

当原代培养细胞经过纯化传至第3代后，按照GFAP（Sigma，USA）及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（碧云天公司）免疫荧光染色方法进行操作，然后应用荧光共聚焦显微镜拍照。其中GFAP阳性细胞胞质呈明亮的黄、绿色荧光，活细胞的细胞核呈DAPI阳性的蓝色荧光。GFAP阳性细胞数占DAPI阳性细胞数的百分比即为星形胶质细胞的纯度，纯度＞95%方可用于实验。

1.3 改良糖氧剥夺模型的建立及分组

鉴定合格及纯化的星形胶质细胞用PBS清洗3次后，加入适量含有浓度为10mmol／L的连二亚硫酸钠的无血清无糖DMEM培养液，转移到预先充满混合气体（10%H2，85%N2和5%CO2）的37℃厌氧培养箱中，进行缺血缺氧培养［2］。将细胞随机分成对照组（OGD 0h）和糖氧剥夺组，再按持续糖氧剥夺时间分为OGD（1、2、3、4、6h）组。每组各指标独立重复检测4次。

1.4 流式细胞仪检测细胞胀亡及凋亡

使用默克公司Annexin V-FITC／PI Apoptosis Detection Kit目录中货号为PF032的产品，根据说明书进行标记操作后立即用流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）检测分析。每个样品计数5 000个细胞。

1.5 星形胶质细胞ATP含量检测

细胞内ATP水平测定选用ATP生物荧光测定试剂盒（Beyotime，中国，目录号S0026），根据产品说明书操作。ATP含量单位为nmol／mg蛋白。

1.6 星形胶质细胞钠钾ATP酶活性检测

试剂盒购自南京建成生物工程研究所。采用定磷法，利用ATP酶可以催化ATP分解生成ADP和无机磷的原理，通过酶标仪（Biotek公司，美国）测定无机磷的生成量来判断ATP酶活性高低。

1.7 Western blot测定NKCC1表达水平

弃培养液，加入2mL预冷的PBS，用细胞刮刮下细胞，转移至试管，1 000r／min离心5min，去上清，每管细胞加300μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，于4℃下12 000r／min离心5min，将离心后的上清分装转移到0.5mL的离心管，用BCA蛋白浓度测量法测蛋白浓度。经聚丙烯酰胺凝胶电泳（南京建成生物公司），90V、1.5h电转移至PVDF膜，TBST漂洗3次，含有5%脱脂奶粉的TBST常温封闭1h，一抗孵育过夜。使用1∶1 000NKCC1抗体（Sigma，USA），1∶1 000β-actin抗体（Santa Cruz，USA），一抗孵育完成后TBST漂洗3次，辣根过氧化物酶结合的二抗（英韦创津，美国）常温孵育1h，TBST充分洗涤后以ECL法显色并拍照。

1.8 统计学方法

使用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析，组间均数比较采用方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GFAP荧光染色鉴定星形胶质细胞

如图1所示，DAPI染色中蓝紫色为星形胶质细胞的细胞核，GFAP染色中黄绿色为星形胶质细胞胞质内的GFAP，鉴定显示GFAP阳性的星形胶质细胞纯度超过95%。

图1 星形胶质细胞荧光染色鉴定（×200）Fig.1 Identification of astrocytes by fluorescent staining（×200）

2.2 各组细胞的存活率、凋亡率及胀亡率比较

采用经典的AnnexixⅤ／PI染色流式细胞术检测各组细胞死亡率。流式细胞图左上象限Q1:AnnexinⅤ－／PI＋，为机械损伤和细胞膜基本不存在的坏死细胞；右上象限Q2:AnnexinⅤ＋／PI＋，为早期胀亡细胞；左下象限Q3:AnnexinⅤ－／PI－，为正常活细胞；右下象限Q4:AnnexinⅤ＋／PI－，为早期凋亡细胞。图2、3显示在不同OGD时间星形胶质细胞的主要死亡方式。采用方差分析对各组细胞进行统计学分析，结果显示:OGD 2h胀亡细胞率（8.32 ±0.86）%与凋亡细胞率（9.33±0.87）%相比差异无统计学意义（P＞0.05）；而OGD 3h胀亡细胞率（9.54±1.47）%超过凋亡细胞率（7.69±0.80）%，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。提示随OGD的时间延长凋亡细胞率逐渐下降，胀亡细胞率逐渐增高，在OGD 3h后星形胶质细胞主要通过胀亡途径走向死亡。

图2 AnnexinⅤ／PI流式细胞染色检测不同OGD时间星形胶质细胞的胀亡率和凋亡率Fig.2 AnnexinⅤ／PI flow cytometry analysis of the oncosis rate and the apoptosis rate of astrocytes at different time points of OGD

图3 不同OGD时间点星形胶质细胞的胀亡率和凋亡率Fig.3 The oncosis rate and the apoptosis rate of astrocytes at different time points of OGD

2.3 各组星形胶质细胞ATP含量

如图4所示星形胶质细胞ATP含量随OGD时间的延长而下降，方差分析显示各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 各组细胞的Na＋，K＋-ATPase活性

星形胶质细胞进行OGD处理1、2、3、4、6h后测定各组细胞的Na＋，K＋-ATPase活性，方差分析显示，Na＋，K＋-ATPase活性随OGD时间的延长而下降，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图4 星形胶质细胞ATP含量随OGD时间的变化Fig.4 Changes of the ATP content in astrocytes with OGD

图5 星形胶质细胞钠钾ATP酶活性随OGD时间的变化Fig.5 Changes of the activity of Na＋-K＋-ATPase in astrocytes with OGD

2.5 各组细胞的NKCC1表达水平

Western blot结果显示，NKCC1的表达随着OGD时间的延长先增加后减少，在OGD 3h后明显减少，见图6。

图6 Western blot检测不同OGD时间细胞NKCC1的表达水平Fig.6 Western blot analysis of the expression of NKCC1at different time points of OGD

3 讨论

研究认为当脑组织缺血缺氧后可以产生脑缺血中心区及脑缺血半暗带区，当缺血缺氧时间进一步延长及灌注量进一步下降，脑缺血中心区的范围就会向半暗带区扩大，引起严重的功能障碍［5］。本课题组在前期研究中观察到大鼠脑组织缺血中心区星形胶质细胞死亡以胀亡途径为主，而周边区则以凋亡为主；在同一个病灶中，细胞胀亡和凋亡可同时存在且有一定的分布特征，在能量相对充足、血液供应相对丰富部位以凋亡多见，而血供贫乏的区域则细胞胀亡多见。同时褚晓凡等［6－7］在大鼠的MCAO模型中发现，鼠缺血缺氧中心区的星形胶质细胞细胞死亡主要是以肿胀、破碎为主的，缺血缺氧中心区星形胶质细胞肿胀、核溶解的形态与胀亡的形态学变化相吻合。胀亡（oncosis），主要表现为受损后的细胞体积扩大，膜完整性破坏、通透性增加，DNA裂解成为非特异性片段，最后细胞溶解，胞质漏出并伴有周围组织炎症反应［8］。

我们在本次实验中，通过改良型的糖氧剥夺模型能模拟缺血缺氧中心区星形胶质细胞的损伤，使用AnnexinⅤ＋PI双染方法发现随着糖氧剥夺时间的增加，正常存活的细胞越来越少（Q3象限），AnnexinⅤ阳性的细胞比例未见明显变化（Q4象限），而PI阳性的细胞比例随着糖氧剥夺时间的增加而上升，这意味着细胞膜通透性改变的细胞比例增加（Q1＋Q2象限），在糖氧剥夺3h时，其细胞比例超过了AnnexinⅤ阳性的细胞比例（图2、3）。这提示在缺血缺氧中心区，同时存在着凋亡和胀亡等多种死亡途径。在糖氧剥夺的开始阶段星形胶质细胞启动凋亡死亡途径来适应外界的环境，在持续的糖氧剥夺过程中，星形胶质细胞的能量进一步耗竭，从而进一步被动地启动胀亡途径，并在糖氧剥夺3 h后占据主导地位，3h也许是凋亡转向胀亡方式的一个时间点。同时另有报道显示，持续性的糖氧剥夺会降低细胞内的ATP水平，随着时间的增加呈线性下降，当细胞内的ATP水平下降至35%以下，星形胶质细胞会表现为胀亡的死亡方式，细胞膜通透性改变并释放大量的炎症因子［9］。

Na＋，K＋泵衰竭是离子泵功能障碍的主要部分［10］。Na＋，K＋-ATPase是镶嵌在细胞质膜脂质双分子层中的一种蛋白质，具有载体和酶的活性。哺乳动物的细胞中，钠钾ATP酶（Na＋，K＋-ATPase）的最基本作用是维持细胞内外钠钾离子浓度梯度——细胞内钾浓度高，细胞外钠浓度高。其产生、维持细胞的静息电位需要消耗ATP。钠钾ATP酶需要消耗1个分子ATP才能将3个Na＋逆浓度梯度转运出细胞，同时将2个K＋逆浓度梯度转运入细胞［11－12］。这种离子浓度梯度维持细胞膜正常形态和细胞容积；维持细胞内环境的稳定和细胞内外钾离子的正常浓度；并为钠离子的被动转运提供势能。Na＋，K＋-ATPase的功能障碍，将引起一系列细胞功能紊乱，如钙超载、线粒体肿胀、细胞水肿等，继而导致不可逆的细胞死亡［13］。Na＋，K＋－ATPase所介导的K＋内流在L-谷氨酸介导的星形胶质细胞肿胀中亦起关键作用［14］。

本实验中星形胶质细胞其Na＋，K＋-ATPase活性随OGD时间的延长而降低，流式细胞仪测得的胀亡细胞率则随OGD时间的延长而增多，可见胀亡细胞率随Na＋，K＋-ATPase活性降低而升高。我们的前期研究已发现，星形胶质细胞的ATP随OGD时间的延长而逐渐下降，胀亡率明显升高，在OGD 3h内胀亡率小于凋亡率，3h起逐渐超过凋亡率，成为星形胶质细胞的主要死亡方式［9］。综合分析，我们有如下推测:①ATP水平可影响细胞死亡的方式，同一刺激下细胞出现凋亡还是胀亡，取决于ATP的量，如果能量不足，凋亡无法完成其程序，则细胞转向胀亡，这样通过影响胞内ATP水平，从而决定细胞死亡方式。有实验表明，在补充ATP后，细胞胀亡可转为凋亡形式的死亡［15］。可以认为同样的OGD刺激，作用时间短主要走凋亡程序，作用时间长主要走胀亡程序。此结论跟早前其他研究者的结论一致:细胞凋亡和胀亡可由同一种刺激导致［16］，并且跟刺激强度、作用时间有关。强度较弱，作用时间较短时，以凋亡为主；相反，刺激强度大，作用时间长，细胞损伤相对严重时，则细胞死亡主要以胀亡方式［17］。②缺血缺氧中心区细胞损伤严重，引起细胞内ATP的产生明显减少，由于细胞Na＋，K＋-ATPase的跨膜离子转运需要消耗ATP，当ATP不足时Na＋，K＋-ATPase活性降低，导致Na＋通过氧化应激激活非选择性阴离子通道进入细胞，进一步通过钠钙交换，导致细胞内钙超载，随后水在渗透压的作用下通过自由扩散进入细胞内，引起细胞肿胀，同时因为缺乏ATP导致细胞不能完成凋亡这一耗能过程，故进入胀亡途径。

NKCC1是细胞膜上的固有膜蛋白，在细胞体积调节和离子平衡中起到重要作用［18－19］。它通过Na＋，K＋-ATPase建立起来的细胞内外的Na＋浓度梯度势能，以1∶1∶2的比例将Na＋、K＋、Cl－转运入细胞内，然而由于Na＋、K＋可以很快地被Na＋，K＋-ATPase转运出入细胞。而NKCC1协同转运蛋白对离子转运的同时，伴随着水进入细胞，且细胞体积的增加大约发生于细胞外K＋浓度增加后的2.6s。同时NKCC1可以对抗细胞外的渗透压，将水分子转运入细胞内，从而进一步导致细胞的肿胀［20］。由于NKCC1的活动是继发性主动转运，它需要Na＋，K＋-ATPase建立起来的细胞内外溶质渗透梯度供给能量，NKCC1作为一种细胞上的固有膜蛋白，在脑缺血早期阶段是细胞外的高K＋环境，NKCC1可以承载Na＋、K＋、Cl－和水进入细胞内，造成神经胶质细胞的细胞毒性脑水肿，因此NKCC1主要在缺血的早期阶段和再灌注阶段对缺血性脑水肿的形成起到作用［21］。我们的实验也发现，在模拟缺血缺氧中心区星形胶质细胞损伤的过程中，NKCC1的表达随着OGD时间的延长先增加后减少，在OGD 3h后明显减少。我们推测有如下原因:在缺血缺氧早期，氧自由基增加，可以使得培养的星形胶质细胞的NKCC1发生氧化作用和硝化作用，从而增强NKCC1的活性及表达量［22］。而NKCC1表达增加过程中需要消耗更多Na＋，K＋-ATPase建立起来的细胞内外溶质渗透梯度供给能量，因此随着缺血缺氧时间的延长NKCC1的表达量会逐渐减少，同时肿胀的细胞也会进一步破碎，走向坏死结局。

通过本次研究，我们发现不同的糖氧剥夺时期，缺血缺氧中心区星形胶质细胞死亡的主导方式不同，在OGD 3h内以凋亡方式为主，而3h后凋亡方式被抑制，星形胶质细胞死亡通过激活某些途径向胀亡方式转化，其中Na＋，K＋-ATPase活性及NKCC1表达的激活也许是其中的某些途径，这为以后的药物及相关机制的研究奠定了基础。

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（2015－03－06 收稿）

Relationship between the Astrocyte Death Pathway in the Ischemic Core
and the Activity of Na＋，K＋-ATPase or the Expression of NKCC1

Lu Yi，Chu Xiaofan，Huang Qiaoying et al
Department of Neurology，Shenzhen People’s Hospital，Shenzhen 518000，China

Objective To study the relationship between the astrocyte death pathway in the ischemic core and the activity of Na＋，K＋-ATPase or the expression of Na＋-K＋-2Cl－-cotransporter 1（NKCC1）by using modified oxygen and glucose deprivation（OGD）model.Methods Astrocytes of the newborn SD rats（within 24h）were cultured in vitro and the cell purity identified.The oncosis rate and apoptosis rate of astrocytes，the content of ATP，the activity of Na＋-K＋-ATPase and the expression of NKCC1were detected by use of the modified OGD model after OGD for 0，1，2，3，4or 6h.Results The viability of astrocytes was decreased with the extension of OGD.The oncosis rate was greater than the apoptosis rate after 3hOGD.The content of ATP and the activity of Na＋-K＋-ATPase were decreased with the extension of OGD.The expression of NKCC1was first increased and then decreased with the extension of OGD，and it was significantly reduced after OGD for 3h.Conclusion The main death pathway of astrocytes in the ischemic core is apoptosis within 3hof OGD and becomes oncosis after 3-h OGD，which may be related to the Na＋-K＋-ATPase activity and the NKCC1expression.

astrocytes； oxygen-glucose deprivation model； oncosis； Na＋-K＋-ATPase； Na＋-K＋-2Cl－-cotransporter 1

R364.4

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.005

＊国家自然科学基金资助项目（No.30971024），广东省自然科学基金资助项目（No.9151051501000009）

卢 艺，女，1976年生，主治医师，E-mail:1049328794＠qq.com