2,2’,4,4’-四溴联苯醚染毒对大鼠学习记忆及海马NMDA受体亚基基因NR1和NR2B的影响*

且亚玲，汪春梅，阳静，汤艳

（泸州医学院公共卫生学院,四川泸州646000）

2,2’,4,4’-四溴联苯醚染毒对大鼠学习记忆及海马NMDA受体亚基基因NR1和NR2B的影响*

且亚玲，汪春梅，阳静，汤艳

（泸州医学院公共卫生学院,四川泸州646000）

目的:观察2,2’,4,4’-四溴联苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromo-diphenyl ethers，BDE-47）染毒后大鼠学习记忆及海马NMDA受体亚基NR1和NR2B的变化，探讨BDE-47暴露对学习记忆的影响及其机制。方法:将80只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、溶剂对照组、BDE-47（0.1 mg/Kg、0.5 mg/Kg和1.0 mg/Kg）剂量组，每组16只，每天灌胃1次，持续30 d；用Morris水迷宫检测学习记忆，用免疫组化检测大鼠NMDA受体亚基NR1和NR2B的表达，用RT-PCR检测大鼠NMDA受体亚基NR1和NR2B的基因表达。结果：在水迷宫试验中：与溶剂对照组比较，BDE-47染毒各组的平均逃避潜伏期明显增加、穿越平台的次数和在原平台象限停留的时间明显减少（P＜0.05），且呈剂量-反应关系（P＜0.05）。免疫组化结果：与溶剂对照组比较，各染毒组大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B表达明显减少（P＜0.05），且呈剂量-反应关系（P＜0.05）。RT-PCR结果与溶剂对照组比较，BDE-47染毒各组大鼠海马NMDA受体亚基NR1的基因表达明显减少（P＜0.05）；各染毒剂量组之间，随着染毒剂量的增加，大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B的基因表达减少（P＜0.05）。结论:BDE-47染毒后大鼠学习记忆能力降低，可能与大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B减少有关。

BDE-47；海马；NMDA受体；学习记忆

2,2’,4,4’-四溴联苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ethers,BDE-47）是环境和人体中含量最高的PBDEs同系物，BDE-47不仅对环境造成严重污染，还对人群健康存在潜在的危害。实验数据表明BDE-47对实验动物具有一定的肝脏毒性、生殖毒性、内分泌干扰毒性，对人类具有潜在的神经行为毒性[1-2]。但是目前对BDE-47的神经行为毒性研究才刚起步，故本研究以成年大鼠为研究对象，模拟BDE-47环境暴露剂量，对大鼠染毒一个月，观察大鼠学习记忆及海马NMDA受体亚基NR1和NR2B的变化，研究低剂量BDE-47暴露对学习记忆的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年雄性Sprague Dawley大鼠80只（由泸州医学院动物实验中心提供），体重200 g±10 g，活动和学习能力相近。饲养条件，温度23.1℃，湿度50%± 10%，常规饲料喂养。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器

Morris水迷宫（北京硕林苑科技有限公司），SW-LJ-IF超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；8751超低温冰箱（美国Forma公司）；5417高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；SIF-M124制冰机（日本三洋公司）；GeneAmp 9700型PCR仪（ABI）；ND-1000核酸蛋白检测仪（美国Nanodrop公司）；Tannon2500凝胶图像扫描系统（美国BIO-RAD公司）。

1.2.2 主要试剂

BDE-47（纯度100%，美国AccuStandard公司），NR1和NR2B抗体（Bioworld Technology inc）；Rever Tra Ace组合型RT-PCR试剂盒（成都博瑞克生物技术有限公司）；Trizol试剂和焦碳酸乙二脂（DEPC）（Invitrogen公司）；溴化乙锭（上海生物工程有限公司）。

1.3 动物模型的建立

利用随机数据表将80只SD雄性大鼠随机分为：空白对照组、溶剂对照组、BDE-47低剂量（0.1 mg/kg）组、中剂量（0.5 mg/kg）组、高剂量（1.0 mg/kg）组，每组16只。每天上午9∶00～11∶00，对BDE-47低、中、高剂量组分别按0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/ kg灌胃给予BDE-47（BDE-47用纯花生油配置），溶剂对照组按1.0 mg/kg灌胃给予纯花生油，连续灌胃30 d。

1.4 大鼠学习记忆的测定

BDE-47染毒结束后第2 d，用Morris水迷宫对大鼠学习记忆能力进行测试，测试方法参照文献[3]进行。①定位航行实验：历时4 d，观察和记录每天大鼠寻找平台的逃避潜伏期，并计算平均逃避潜伏期;②空间搜索实验：即在第4 d最后1次训练后撤除水下平台，然后任选同一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录60 s内跨过平台相应位置的次数。

1.5 大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B免疫组化的测定

水迷宫测试结束后,用10%水合氯醛对大鼠腹腔注射,麻醉后立即开胸暴露心脏,经左心室插管至主动脉,同时剪开右心耳,快速灌注生理盐水,至肝脏变白改灌注液为4%多聚甲醛,灌注时间约30 min,见大鼠尾巴、四肢僵硬视为满意,然后开颅快速取出大脑组织投入4%多聚甲醛溶液中固定,石蜡包埋切片,免疫组化按免疫组化试剂盒说明进行。用Image-Proó Plus 6.0(IPP)分析免疫组化图片的光密度。

1.6 大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B的基因表达检测（RT-PCR）

1.6.1 组织总RNA的提取

BDE-47染毒结束后第2 d，断头处死大鼠，快速取海马，剪取80 mg，剪碎后转移至玻璃匀浆器中，加入1 mL Trizol进行匀浆处理。室温放置5 min后加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置5 min，4℃12 000 r/min离心15 min。转移水相于新EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀后冰上沉淀10 min，4℃12 000 r/min离心10 min，管底部可见胶状RNA沉淀，弃上清，加1 mL 75%乙醇充分混匀洗涤RNA沉淀，4℃7 500 r/min离心5 min，弃上清。室温放置干燥约10 min后用无RNase的水进行溶解。核酸蛋白检测仪上检测提取的总RNA浓度、纯度。

1.6.2 cDNA的合成

取1 μg总RNA做模板，按照逆转录试剂盒说明书配制20 μL反应体系：总RNA 1 μg，dNTP Mixture 2 μL，5×RT buffer 4 μL，Super RI 0.5 μL，RF enhancer 0.5 μl，Random Primer 1 μL，Rever Tra Ace酶1 μL，补DEPC水至终体积20 μL。按以下程序进行cDNA的合成：30℃10 min，42℃20 min，99℃5 min。

1.6.3 PCR扩增目的基因

取上述产物进一步进行PCR扩增，反应体系中含cDNA 2 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，补水至终体积20 μL。基因名称和对应的引物序列、扩增条件，表1。

表1 PCR引物序列和扩增条件

1.7 统计分析

应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，多组间均数比较采用重复测量方差分析和单因素方差分析，两两比较用LSD法，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BDE-47对大鼠学习记忆的影响

2.1.1 定航实验

在Morris水迷宫定航实验中，重复测量方差分析结果显示：训练时间和染毒剂量对大鼠平均逃避潜伏期的影响无交互作用（F=0.62，P=0.65），不同训练时间的染毒组大鼠的平均逃避潜伏期差异有统计学意义（F=638.30，P＜0.0001）。同一训练时间，BDE-47染毒组平均逃避潜伏期均高于溶剂对照组（P＜0.05），且随染毒剂量的增加而增加（P＜0.05），空白对照组与溶剂对照组比较差异无统计学意义，P＞0.05，表2。

表2 大鼠Morris水迷宫定航实验平均逃避潜伏期（±s，n=16）

表2 大鼠Morris水迷宫定航实验平均逃避潜伏期（±s，n=16）

注：a.表示与空白对照组比较，P＞0.05；b.表示与溶剂对照组比较，P＜0.05；c.表示与BDE-47低剂量组比较，P＜0.05；d.表示与BDE-47中剂量组比较，P＜0.05

组别空白对照组溶剂对照组低剂量组中剂量组高剂量组F P第1 d 29.27±6.46 32.17±5.98a42.32±6.34b49.42±5.25bc55.85±4.94bcd37.83＜0.001第2 d 26.62±5.40 25.46±3.35a36.19±6.05b48.16±5.89bd52.46±4.89bcd50.49＜0.001第3 d 11.68±4.96 12.10±4.19a24.55±5.21b32.07±7.29bc42.64±7.66bcd49.26＜0.001第4 d 5.26±3.84 6.89±3.48a11.68±5.89b16.89±6.15bc26.92±6.34bcd34.16＜0.001

2.1.2 空间搜索实验

在Morris水迷宫空间实验中，BDE-47低、中、高剂量组大鼠穿越原平台的次数和在原平台象限停留的时间较溶剂对照组明显减少（P＜0.05），且随染毒剂量的增加而减少，差异均有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与溶剂对照组差异无统计学意义，P＞0.05，表3。

表3 各组成年大鼠Morris水迷宫空间搜索实验垮台次数（±s，n=16）

表3 各组成年大鼠Morris水迷宫空间搜索实验垮台次数（±s，n=16）

注：a.表示与空白对照组比较，P＞0.05；b.表示与溶剂对照组比较，P＜0.05；c.表示与BDE-47低剂量组比较，P＜0.05；d.表示与BDE-47中剂量组比较，P＜0.05

在原平台象限停留时间33.37±5.90 35.89±5.15a26.83±5.32b16.90±5.00bc12.11±4.60bcd65.07＜0.0001组别空白对照组溶剂对照组低剂量组中剂量组高剂量组F P穿越原平台的次数4.92±1.96 4.73±1.42a3.77±1.25b2.67±1.10bc1.38±0.88bcd26.69＜0.0001

2.2 BDE-47对大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B的影响

2.2.1 免疫组化结果

免疫组化结果显示：大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B阳性表达在胞浆，染色为黄色，染色越深阳性表达就越多。与溶剂对照组比较，各染毒组大鼠海马CA1、CA3和齿状回（DG）的NMDA受体亚基NR1和NR2B表达明显减少（P＜0.05）；且随着染毒剂量的增加，大鼠海马CA1、CA3和齿状回（DG）的NMDA受体亚基NR1和NR2B阳性表达均逐渐减少（P＜0.05），溶剂对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），图1、图2和表4。2.2.2 RT-PCR结果

RT-PCR结果显示：与溶剂对照组比较，BDE-47染毒各组大鼠海马NMDA受体亚基NR1的基因明显减少（P＜0.05），BDE-47染毒中剂量、高剂量组大鼠海马NMDA受体亚基NR2B的基因明显减少（P＜0.05）；各染毒剂量组之间，随着染毒剂量的增加，大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B的基因均逐渐减少（P＜0.05），溶剂组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表5和图3。

图1 大鼠海马NMDA受体亚基NR1的表达结果（×400）

图2 大鼠海马NMDA受体亚基NR2B的表达结果（×400）

表4 大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B的光密度值（±s，n=8）

表4 大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B的光密度值（±s，n=8）

注：a.表示与空白对照组比较，P＞0.05；b表示与溶剂对照组比较，P＜0.05；c.表示与BDE-47低剂量组比较，P＜0.05；d.表示与BDE-47中剂量组比较，P＜0.05

组别空白对照组溶剂对照组低剂量组中剂量组高剂量组F P CA1 0.1685±0.0110 0.1615±0.0084a0.1275±0.0062b0.1012±0.0111bc0.0633±0.0083bcd176.72＜0.0001 NR1 NR2B CA3 0.1577±0.0079 0.1608±0.0063a0.1291±0.0056b0.0947±0.0059bc0.0588±0.0060bcd369.92＜0.0001 DG 0.1579±0.0100 0.1679±0.0117a0.1338±0.0140b0.1063±0.0078bc0.0789±0.0163bcd70.94＜0.0001 CA1 0.1699±0.0077 0.1712±0.0076a0.1709±0.0091b0.1093±0.0081bc0.0718±0.0136bcd181.77＜0.0001 CA3 0.1807±0.0130 0.1829±0.0108a0.1876±0.0123b0.1437±0.0101bc0.1013±0.0124bcd78.48＜0.0001 DG 0.2237±0.0107 0.2208±0.0110a0.2170±0.0132b0.1673±0.0101bc0.1099±0.0110bcd152.97＜0.0001

表5 大鼠海马NMDA受体亚基NR1的基因表达（±s，n=8）

表5 大鼠海马NMDA受体亚基NR1的基因表达（±s，n=8）

注：a.表示与空白对照组比较，P＞0.05；b.表示与溶剂对照组比较，P＜0.05；c.表示与BDE-47低剂量组比较，P＜0.05；d.表示与BDE-47中剂量组比较，P＜0.05

组别空白对照组溶剂对照组低剂量组中剂量组高剂量组F P NR1 2.2381±0.1027 2.1835±0.0898a1.7637±0.1044b1.3097±0.0465bc1.1049±0.0400bcd310.26＜0.0001 NR2B 0.8822±0.0721 0.9060±0.0693a0.8950±0.0827 0.6202±0.0583c0.4685±0.0320cd78.68＜0.0001

图3 大鼠海马NMDA受体亚基NR1的基因表达

3 讨论

目前BDE-47的神经行为毒性已经成为全球研究的热点之一。国外学者Eriksson等[4]研究发现，一次给予刚出生10 d的小鼠10.5 mg/kg的BDE-47，导致小鼠运动行为异常，成年后学习记忆能力明显下降。国内学者何平等[5]用5 mg/kg和10 mg/kg的BDE-47单次染毒刚出生10 d的SD大鼠，导致大鼠两个月龄时空间学习记忆能力下降。本研究发现，低剂量（0.1 mg/Kg、0.5 mg/Kg和1.0 mg/Kg）BDE-47染毒成年大鼠1月后，大鼠学习记忆能力明显下降，且呈剂量-反应关系。

海马是脑边缘系统中重要的结构之一，是学习记忆等高级神经活动的重要部位。国内学者何卫红等[5-7]研究发现BDE-47可致原代新生大鼠海马细胞氧化应激和诱导细胞DNA损伤和凋亡以及海马CA1区神经元超微结构的损伤、影响大鼠海马区钙信号诱导的凋亡相关基因mRNA表达水平。表明BDE-47可通过损害海马神经元，导致学习记忆能力的下降，具有一定神经行为发育毒性。海马长时程突触增强（long-term potentiation，LTP）是学习记忆的神经生物学基础。Dingeman等[8]用BDE-47 6.8 mg/kg/d染毒出生10 d小鼠，海马长时程增强效应和强直刺激后增强效应减弱。N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methy-D-Aspartic acid，NMDA）受体为代表的活动依赖的兴奋性离子型谷氨酸受体在LTP形成和维持中具有重要作用。NMDA受体有7种NMDA受体亚单位，即NRI、NR2A～D、NR3A和NR3B。NR1为功能亚单位，是NMDA受体的必需组分，选择性敲除小鼠海马CA1区锥体细胞的NR1亚单位后，其NMDA受体诱导的LTP被破坏，且小鼠表现为空间记忆障碍。NR2是调节亚单位，胞外段有谷氨酸结合位点，胞内段C端较长且包含有磷酸化位点，并由此调节受体功能和活化水平，应用反义寡核苷酸选择性敲除幼年大鼠海马NR2B亚单位后，NMDA受体的反应性降低，NMDA受体依赖性LTP丧失，同时空间学习能力受损[9]。而本研究发现低剂量（0.1 mg/ Kg、0.5 mg/Kg和1.0 mg/Kg）BDE-47染毒成年大鼠1月后，海马NMDA受体亚基NR1和NR2B蛋白和基因表达减少，故提示低剂量BDE-47染毒对学习记忆的损害可能与海马NMDA受体亚基NR1和NR2B表达减少有关，但是具体的作用机制还需进一步研究。

1.Li T,Wang W,Pan YW,et al.hydroxylated metabolite of flame-retardant PBDE-47 decreases the survival,proliferation,and neuronal differentiation of primary cultured adult neural stem cells and interferes with signaling of ERK5 MAP kinase and neurotrophin 3[J].Toxicol Sci, 2013,134(1):111-124.

2.Wilford BH,Shoeib M,Harner T,et al.Polybrominated diphenyl ethers in indoor dust in Ottawa,Canada:implications for sources and exposure[J].Environ Sci Technol, 2005,39(18):7027-7035.

3.袁琼嘉,李垂坤,李雪,等.长期中等负荷运动对大鼠空间学习记忆及海马神经黏附分子的影响[J].中国运动医学杂志,2012,31(12):1075-1080.

4.Eriksson P,Ankarberg E,Viberg H,et al.The developing cholinergic system as target for environmental toxicants,nicotine and polychlorinated biphenyls(PCBs):implications for neurotoxicological processes in mice[J].Neurotox Res,2001,3(1):37-51.

5.何平,王爱国,夏涛,等.BDE-47单独和与PCB-153联合染毒对大鼠神经发育的影响[J].环境与健康杂志, 2008,25(9):763-766.

6.何卫红,何平,张明,等.2,2’,4,4’-四溴联苯醚对原代新生大鼠海马细胞氧化应激、DNA损伤和凋亡的影响[J].环境与健康杂志,2007,24(1):19-22.

7.夏涛,何平,王爱国,等.PBDE-47和PCB153染毒致大鼠神经毒性作用[J].中国公共卫生,2009,25(5):564-566.

8.Dingemans MM,Ramakers GM,GardoniF,et al. Neonatal exposure to brominated flame retardant BDE-47 reduces long-term potentiation and postsynapticprotein levels in mouse hippocampus[J].Environ Health Perspect, 2007,115(6):865-870.

9.Tang YP,Shimizu E,Dube GR,et al.Genetic enhancement of learning and memory in mice[J].Nature,1999, 401(6748):63-69.

（2015-01-06收稿）

作者投稿系统http∶//xb.lzmc.edu.cn/

Effect of BDE-47 exposure on learning and the expression of genes memory and NR1 and NR2B of Hippocampal neurons in adult rat

Qie Yaling，Wang Chunmei，Yang jiny，Tang Yan
Department of Public and Health,Luzhou Medical College

Objiective:To study the effect and mechanism of 2,2’,4,4’-tetrabromo-diphenyl ethers(BDE-47)exposure on spatial learning and memory abilities and the genes expression of NMDA-receptor subunit in adult rats.Methods:80 healthy male SD rats were randomly divided into control group,vehicle group and three BDE-47-treated groups.The latter3 treated groups were treated by intragastric administration of 0.1 mg/kg,0.5 mg/kg and 1.0 mg/kg BDE-47 once a day respectively.The rats in vechicle group

1.0 mg/kg of peanut oil.The administration was lasted for 30 days.After experiment the capability of learning and memory of rats were measured by Morris water maze test.The expressions of both subunits of NMDA-receptor were evaluated by immunohistochemisty.Results:In BDE-47-treated groups the average escape latency was increased compared with control group(P＜0.05),and the freguency the animal crossed the original platform and the time spent in quadrant of the original platform were decreased compared with control group and dosage related(P＜0.05).The expression of NR1 and NR2B in CA1,CA3 and dentate gyrus areas of hippocampus were significantly decreased in the BDE-47 treated groups compared with the vehicle group and dosage related(P＜0.05).And the expression mRNA of NR1 and NR2B showed statistically signifcant decrease in rats exposed to BDE-47.Conclusions: These findings show that the exposure to BDE-47 can induce behavioral alterations which may be due to the down-regulation of the genes expression of subunits of NMDA receptors.

2，2’，4，4’-tetrabromo-diphenylethers;Hippocampus;N-methy-D-Asparticacid;Learningandmemory

R114

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.02.001

四川省科技厅课题（2010JY0128）；四川省卫生厅项目基金（100207）

且亚玲（1985-），女，助教，硕士，E-mail：690229222@qq.com

汤艳（1976-），女，副教授，硕士，E-mail：Tangyan200310@163.com