豨莶草对尿酸钠引起痛风性关节炎IL—1β、TNF—α、NF—κB表达的影响

徐轶尔 孙贵才 郑春雨 吴洪亮 刘明海 凌小鹏 孙步蟾 涂远青 樊祥伟

【摘 要】目的：研究豨莶草对尿酸钠引起的痛风性关节炎细胞炎性因子的作用机制。方法：选取健康清洁级10～13周龄雄性Wistar大鼠108只，随机分为空白对照组、模型对照组、莶草高剂量组、莶草中剂量组、莶草低剂量组、秋水仙碱组，每组18只。除空白对照组外，其余各组均通过尿酸钠致大鼠痛风性关节炎模型，用莶草不同剂量和秋水仙碱对模型大鼠灌胃给药。观察各组大鼠关节组织的病理学变化和测定白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、核转录因子-κB（NF-κB）的表达。结果：模型对照组大鼠膝关节红肿明显且不敢发力，肿胀关节浸出液中IL-1β、TNF-α、NF-κB水平显著升高，滑膜细胞增生、炎性细胞浸润，排列紊乱，成纤维细胞增生，组织坏死并且炎性渗出。莶草高、中剂量组治疗效果明显，红肿减弱，莶草高剂量组周围软组织中炎细胞浸润并不明显，肿胀关节浸出液中IL-1β、TNF-α、NF-κB均显著降低。结论：莶草通过抑制IL-1β、TNF-α、NF-κB表达，可有效抑制痛风性关节炎局部的炎症反应。

【关键词】 痛风性关节炎;豨莶草;尿酸钠;IL-1β;TNF-α;NF-κB;大鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.01.002

Effects of Xixiancao on the Expression of IL-1β，TNF-α and NF-κB of Gouty Arthritis Caused by Sodium Urate

XU Yi-er，SUN Gui-cai，ZHENG Chun-yu，WU Hong-liang，LIU Ming-hai，LING Xiao-peng，SUN Bu-chan，

TU Yuan-qing，FAN Xiang-wei

【ABSTRACT】Objective：To research the mechanism of action of Xixiancao[Herba Siegesbeckiae]to the cell inflammatory factor of gouty arthritis induced by sodium urate.Methods： 108 Wistar male rats of clean grade 10-13 weeks were randomly divided into blank control group，model control group，Xixiancao high dose group，Xixiancao middle dose group group，Xixiancao low dose group and colchicine group，18 rats in each group.Except for the blank control group，the other groups by gouty arthritis rat model induced by sodium urate.The models were given different dosage of Xixiancao and colchicine by intragastric administration，observing their pathological changes of articular tissue and measuring the expression of IL-1β，TNF-α and NF-κB.Results：The rats in the model control group had knee joint swelling obviously and couldnt move with force.The level of IL-1β，

TNF-α and NF-κB in the leachate form the swollen joints significantly increased.There were synovial cell hyperplasia，inflammatory cell infiltration，arrangement in disorder，fibroblast proliferation，tissue necrosis and inflammatory exudation.The therapeutic effect of the high and middle dose groups of Xixiancao was obvious and red swelling weakened.The phlogocyte infiltration in surrounding soft tissue of the high dose group of Xixiancao was not obvious and IL-1β，

TNF-α  and NF-κB in the leachate form the swollen joints significantly decreased.Conclusion：By the expression of IL-1β，TNF-α and NF-κB，Xixiancao could effectively inhibit the local inflammatory reaction of gouty arthritis.

【Keywords】 gouty arthritis;Xixiancao;sodium urate;IL-1β;TNF-α;NF-κB;rat

痛风（gout）是由于嘌呤代谢紊乱，尿酸生成过多或排泄减少，造成血尿酸水平增高，尿酸盐结晶在体内沉积所致的一组异质性疾病。其临床表现为由高尿酸血症、尿酸盐沉积所导致的反复发作的急、慢性关节炎和软组织损伤[1]。笔者前期研究发现，复方莶草胶囊治疗急性痛风，抗炎镇痛作用快、药效强、副作用小，其发挥抗炎的机制可能是抑制滑膜细胞IL-1β和IL-8的合成，进而抑制前列腺素等其他炎症介质的释放而发挥抗炎镇痛作用[2]。而作为复方莶草胶囊的君药，莶草如何发挥抗炎镇痛作用，目前还没有相关报道，因此，本实验通过观察尿酸钠致大鼠关节炎滑膜，研究莶草对IL-1β、TNF-α、NF-κB的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康清洁级10～13周龄雄性Wistar大鼠108只，体质量200～220 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK黑2008004，Wistar大鼠分笼饲养，饲养环境室温22～24 ℃，饲养2周，自由饮食、饮水和自然光照。

1.2 药品与试剂 莶草（由黑龙江中医药大学制剂室提供）经浸泡后煎煮成汤剂，每毫升药液中含有生药3.6 g。莶草低、中、高剂量组的给药剂量分别为18，36，72 g·kg-1·d-1，秋水仙碱组给药剂量为0.03 mg·kg-1·d-1，秋水仙碱片由云南制药有限公司生产，用蒸馏水按0.003 mg·mL-1配成悬浊液，每次使用时注意涡旋混合。RNA提取试剂，Trizol（美国Invitrogen公司）;逆转录试剂，AccuPowerR RocketScriptTM RT Premix（韩国Bioneer公司）;PCR反应试剂，2x Es Taq MasterMix（北京康为世纪生物科技有限公司）。

1.3 仪 器 超净工作台，Sw-GJ-IF型（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）;倒置显微照相系统（日本OLMPUS公司）;倒置显微镜，DMIRB型（德国LEICA公司）;XJ-70型电子分析天平DF-110型（常熟衡器工业公司）;PCR仪（杭州博日科技LifeExpress PCR扩增仪）。

2 方 法

2.1 实验方法

2.1.1 尿酸钠所致大鼠急性关节炎模型建立 取戊巴比妥钠适量，精密称量用生理盐水溶解，配制成2%浓度的戊巴比妥钠溶液，腹腔注射戊巴比妥钠0.2 mL·100 g-1，按Coderre等经典方法略作改进制作模型。固定大鼠后，清理干净膝关节部位皮毛，在大鼠膝关节表皮成乳白色处用6号注射器刺入，感觉有突破感后注入尿酸钠悬浊液。大鼠单侧踝关节注入足够量的单钠尿酸盐（MSU）晶体可迅速诱导急性关节炎。关节炎发生率为100%[2]。

每个关节0.2 mL尿酸钠悬浊液，相应的空白对照组注射等剂量的生理盐水。

2.1.2 分组 将Wistar大鼠108只饲养1周后，随机分为6组，即空白对照组、模型对照组、莶草高剂量组、莶草中剂量组、莶草低剂量组、秋水仙碱组，每组18只。实验中，均开架分笼饲养，自由摄食，自然光照，并定期清洁、消毒。

2.1.3 给药方法 空白对照组给予每天灌胃生理盐水2 mL，第4天用0.2 mL生理盐水注射大鼠膝关节，然后再灌胃3 d。模型对照组给予每天每只灌胃2 mL生理盐水作为安慰剂，第4天用尿酸钠溶液造模，然后再灌胃3 d。秋水仙碱组给予每天每只灌胃2 mL秋水仙碱混悬液，第4天用尿酸钠溶液造模，然后再灌胃3 d。莶草低剂量组给予每天灌胃莶草混悬液18 g·kg-1，第4天用尿酸钠溶液造模，然后再灌胃3 d。莶草中剂量组给予每天灌胃莶草混悬液36 g·kg-1，第4天用尿酸钠溶液造模，然后再灌胃3 d。莶草高剂量组给予每天灌胃莶草混悬液72 g·kg-1，第4天用尿酸钠溶液造模，然后再灌胃3 d。

2.1.4 HE染色 标本固定于4%多聚甲醛溶液内，用4%的盐酸水溶液脱钙后使用梯度酒精进行脱水，二甲苯透明，石蜡包埋：切片厚度4 μm，置于用防脱片剂处理过的干净玻片上，60%恒温箱中烤片4 h：石蜡切片脱蜡至水，苏木素浸染10 min，

流水冲洗切片1 min，0.5%～1%盐酸酒精分化

3～5 s（颜色由蓝变红），自来水冲冼6 min以上，

l%伊红酒精浸染3～5 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，晾干，中性树胶封片，显微镜下观察关节滑膜组织病理形态学改变。

2.1.5 RT-PCR检测滑膜细胞因子的表达 灌胃

3 d后将大鼠脱臼处死，于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，可见平滑光亮的滑膜组织，用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织。用PBS洗涤

1遍后立即转入组织匀浆器研磨，以1 mL TRIzol抽提总RNA。检测获得的RNA量和纯度后以20 μL

体系将3 μg的RNA逆转录成cDNA模板20 μL，用于PCR检测。所用引物序列大小和PCR条件。见表1。反应程式为94 ℃预变性2 min进入循环，94 ℃变性45 s，不同温度下退火30 s，72 ℃延伸

1 min，循环结束后72 ℃再延伸5 min，降至4 ℃。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳并成像分析，以ImageJ软件（NIH）对产物条带光密度值进行计算。IL-1β、TNF-α、NF-κB与β-actin比值代表目标基因相对表达含量。

2.1.6 IL-1β、TNF-α、NF-κB的测定 取出滑膜组织步骤同2.1.5，分别测定IL-1β、TNF-α、NF-κB，

按试剂盒说明书要求进行操作。

2.1.7 肿胀指数测定 通过2～3 mm宽纸条和游标卡尺测量实验前和造模后不同时间的关节周径，关节肿胀指数=（测定时间点关节周径-初始周径）/

初始周径。

2.2 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果以表示，采用方差分析和Tukey检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组造模后不同时间肿胀度比较 造模后3 d内各组大鼠膝关节肿胀度均有所增高，灌胃治疗后第3天，莶草中高剂量组和秋水仙碱组肿胀度均明显低于模型对照组。见表2。

3.2 莶草对急性痛风性关节炎大鼠滑膜中IL-1β、

TNF-α和NF-κB表达的影响 模型对照组大鼠滑膜中IL-1β、TNF-α和NF-κB炎性因子表达量明显高于空白对照组，秋水仙碱组大鼠关节滑膜中IL-1β、

TNF-α和NF-κB表达量明显低于模型对照组，莶草高、中、低剂量组滑膜中IL-1β、TNF-α和NF-κB表达量与模型对照组比较，差异有统计学意义

（P < 0.05），同时随着莶草剂量的增加，IL-1β、TNF-α和NF-κB表达量逐渐减低。见图1。IL-1β、TNF-α、NF-κB与β-actin光密度比值扫描值见表3。

3.3 莶草对急性痛风性关节炎大鼠病理学改变的影响 空白对照组大鼠周围软组织、关节、滑膜及软骨细胞正常。模型对照组大鼠膝关节红肿明显且不敢发力，滑膜有尿酸盐结晶沉积并且大鼠滑膜细胞增生、炎性细胞浸润，排列紊乱，成纤维细胞增生，组织坏死并且炎性渗出，较好地模拟了人急性痛风性关节炎的病变特点。秋水仙碱组大鼠疗效也十分显著，但大鼠生理状态不佳，大鼠粪便偏稀，活动明显减少，毛发枯乱无光泽极易掉落，体重下降，滑膜组织有坏死、炎性渗出、仍有少量尿酸盐结晶，但明显减少，滑膜组织仍见有炎性的坏死灶，周围轻度水肿。莶草高、中剂量组治疗效果明显，大鼠爬行时双膝敢于发力且红肿减弱，莶草高剂量组周围软组织中炎细胞浸润并不明显，莶草低剂量组大鼠关节处红肿减弱不明显，双膝不能发力，莶草中、低剂量组滑膜组织中仍有尿酸盐的结晶，滑膜组织仍明显水肿和炎细胞浸润。见图2。

3.4 各组滑膜组织的TNF-α和IL-1β含量 酶联免疫检测技术测定各组大鼠（每组选择8只大鼠）滑膜组织中TNF-α和IL-1β的含量。结果显示，模型对照组滑膜组织中的TNF-α和IL-1β明显高于空白对照组，莶草高、中、低剂量组与秋水仙碱组滑膜组织中的TNF-α和IL-1β表达量明显低于模型对照组。表明莶草和秋水仙碱能够明显降低滑膜组织中TNF-α和IL-1β炎性因子的表达量，随着莶草给药剂量的增加，对滑膜组织中的TNF-α和IL-1β抑制作用逐渐增大。见表4。

4 讨 论

长期嘌呤代谢障碍引起血尿酸升高，使痛风在全世界范围内发病率逐年升高[4]，降低高尿酸血症是治疗痛风的必要条件，阻止尿酸钠结晶在关节及其周围淤积可减少痛风的发作[5]。尿酸钠晶体能引起炎性细胞侵润，同时引起滑膜细胞与炎症细胞、滑膜细胞与细胞外基质黏附，造成滑膜增生[6]。

有学者认为，MSU可直接刺激滑液中单核细胞导致TNF-α的产生，由于TNF-α可能增强多形核白细胞的活性而使IL-1β释放，所以TNF-α在结晶沉积病中发挥重要作用。西药治疗急性痛风性关节炎虽然能迅速缓解症状，但其明显的不良反应限制了临床应用。中医学认为，痛风乃本虚标实之证，脾肾双亏为本，湿、热、痰、浊、毒凝滞为标。莶草具有清热解毒、祛风除湿、通络止痛的功效，但是作用机制不明确。本实验选择TNF-α与NF-κB作为切入点，是因为TNF-α被认为是炎症细胞因子网链中的第1个细胞因子，能诱导其他细胞因子，TNF-α表达升高导致包括IL-1β、单核细胞刺激因子表达升高，而IL-1β又能提高TNF-α的活性，进而炎症加重。NF-κB在细胞中通常和抑制因子IκB结合，以非活性的状态存在，接受TNF-α的刺激后，进入核内起始转录调节细胞的增殖分化，再由IKKβ刺激IkBα磷酸化进而最终激活了NF-κB[7-8]。实验研究证明了TNF-α能诱导滑膜细胞中NF-κB信号转导通路的活化，这与TNF-α在关节炎滑膜炎症和骨质破坏中的作用密切相关[9]。

本实验结果表明，莶草能降低TNF-α mRNA的转录。核转录因子NF-κB是受TNF-α调节的分子，进而NF-κB mRNA的表达减少。实验结果显示，莶草可以抑制TNF-α诱导滑膜细胞中NF-κB信号转导通路的活化，抑制NF-κB的转录，从而减少IL-1β表达来减轻局部炎症反应，最终抑制急性痛风的病程发展，这可能是莶草发挥治疗急性痛风的机制之一。

5 参考文献

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[2] 孙贵才，于学峰，李登宇.复方豨莶草胶囊对尿酸钠致大鼠关节炎滑膜IL-1β、IL-8含量的影响[J].世界中西医结合杂志，2007，2（6）：329-331.

[3] 黄火高，孙运峰，胡明，等.大鼠急性痛风性关节炎模型的建立及特点[J].军事医学科学院院刊，2005，29（6）：538-542.

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[9] 罗心静，莫选荣，周玲玲.TNF-α诱导类风湿关节炎滑膜细胞NF-κB信号通路活化的探讨[J].免疫学杂志，2012，28（4）：321-323，332.

收稿日期：2014-10-05;修回日期：2014-12-09