我的硕士生发了篇博士水平的论文

马中良

2015年诺贝奖获得者屠呦呦先生，做的是关于中草药青蒿中提取青蒿素的研究。这不禁让我想起自己带的一名研究生张冰洁同学，三年前她开始了中药组份丹参酮的研究，而丹参酮是从丹参根部提取的有效组分。这个课题并不简单，也注定了是一条艰辛的道路，因此对于这个从上海大学本科保送的学生来说，我的梦想是她能够做出一些成绩，最低要求是能发表一篇SCI文章，这在当时已经相当不错了。

选了个难得课题

2012年，刚刚入学的张冰洁同学主动要求开始课题。此时我们课题组的李艳利老师刚从哈佛大学医学院回来不久，她曾参与过丹参酮在肿瘤中作用的相关课题，研究认为丹参酮可以通过抑制一种癌基因的表达水平，从而抑制胰腺癌。而当时，我们课题组主攻目标是微小RNA（microRNA）在肺癌中的作用，而且这个药物能否抑制肺癌也是未知。也因此，我给她确定的课题是：丹参酮-microRNA-肿瘤之间的关系。这个课题无论从基础理论还是将来的应用来看，都有相当的意义，但困难也可想而知。而我们之所以选择这样一个课题，是认为这个题目将来的理论及应用潜力巨大：研究肺癌如何发生的；开发治疗肺癌的相关药物，并找到一些药物的标靶分子。

得到了这个课题后，张冰洁跃跃欲试又忧心忡忡。跃跃欲试是因为她在本科实习的时候接触过肿瘤及细胞生物学的实验，如果能够做好这个课题，将来对科学研究可能兴趣大增；忧心忡忡则是因为课题难度太大，她担心三年时间做不完，因为这个题目之前课题组中没有人开展过，是一项开创性的工作。

迎战各种拦路虎

对于一名一年级的研究生同学来说，要想独立开展一项课题非常不容易。为了做好课题，张同学首先查阅了大量的相关文献，在最短时间掌握了相关实验技能，比如课题涉及到的分子生物学技术：蛋白检测技术（wester blotting）、RNA提取及检测、实时定量PCR技术以及生物信息学预测技术等等。

在真正展开研究之前，需要对课题进行调研并做可行性验证。在这个过程中，张同学遇到了很多问题。比如丹参酮处理了肿瘤细胞以后到底哪些microRNA发生了改变（表达量上升或下降）？这个问题如果放在现在，当然非常简单，只要送到公司，花钱做个细胞测序就好了。但在当时我们是想做探索，不可能也没有那么多钱做这个工作。所以，张同学又阅读了大量的文献，在一些公开发表的数据库资料的基础上做相关分析。与此同时，我也检索了一些文献。最终我们确定了一些癌基因功能，以及抑癌基因功能的microRNA进行实验验证，比如当时已经公认的p53基因，miR-34和let-7等。

除了自己埋头苦干，在涉及到肺癌方面的具体实验时，张同学还不忘向专家同行请教。比如做肿瘤模型小鼠的数据分析、microRNA在肺癌中的可能调控途径分析时，我带着她请教了上海生科院生化细胞所季宏斌研究员，季宏斌研究员也认为中药单体的研究是非常有前途的，这个课题非常有意义，这也给了我们很大的鼓励。在这个过程中，我们还得到了课题组组长、原生化与分子生物学国家重点实验主任金由辛教授的肯定。得到专家学者们的积极反馈，也让我们坚信这个课题是有美好的前景的。虽很辛苦，但值得一试。

一波三折的实验进展

2013年4月到2014年7月，我去美国（MD Anderson Cancer Center）做高级访问学者。那时张同学已经进入研究生二年级下半年，时间已经很紧迫了，而课题进展却遇到了瓶颈，有些实验重复多次也得不到理想的结果。

身在异国，我采取的方法并且可能是唯一可行的方法就是，定期进行视频交流，根据情况制定后续的任务。当时的一个主要难点是确定药物处理后有哪些microRNA发生了变化，从而确认抑制癌症功能的microRNA。而张同学汇报的结果是：所有检测的microRNA表达水平都是上升的。对于这个结果，我认为是不可能的。因为在一个网络调控系统中，不可能所有因素都上调。于是，我确定了两个方案：一是检查实验主要是实时定量PCR的步骤是否有误，做重复实验，每次改变一个影响因素，再进行检测；二是重新用药物处理，从收集细胞到RNA提取、检查每一步，进行详细分析，查找原因。

这样经过一个月的不断交流、实验，张同学终于发现问题可能的所在：实验中对实验技术的要求很高，尤其是对实时定量PCR的样品要求很高，一不小心就容易出错。在我的关注下，张同学的实验不断有了的进展，最终发现丹参酮处理后miR-32有了明显改变。半年以后，我们做了个总结，基本上确定了可以以miR-32为研究目标，以阐明丹参酮处理肿瘤细胞时miR-32表达上升，而由于miR-32可以发挥抑癌基因的功能，最终抑制肿瘤细胞的增殖。

进入研究生三年级之后，张同学的时间越来越紧张了，不过，我们的课题也进入了快车道，实验得心应手，一般每周都能有很好的进展。这些都归功于在长期的研究过程中，她阅读科学文献能力和理解能力的突出，不仅有大量的科学文献做基础，还会积极主动跟进最新课题进展，包括国际上最新的相关文献，同时能将看到的有用的实验技术或者思路运用到自己的课题中。因此，她对研究内容的领悟很快，有时还能提出让我吃惊的看法。比如，她说microRNA-25家族和Let-7家族（另一个著名的microRNA家族，主要是抑癌基因功能）应该有相互协调或相互反馈调控作用，并在实验中主动加入这些抑制肿瘤的microRNA进行研究。其实我也注意到了这个现象，但是不敢和她提起来。因为这个工作应该是一个博士生的工作，或者两个硕士研究生接力去研究的内容。

精益求精改稿件

课题进展得比较顺利之后，张同学开始在我的指导下撰写英文文章。每过一段时间我们还会根据实验最近进展修改，增补文章，这段时间持续了大约半年多。2014年11月，我们的研究得到了课题组李艳利老师，金由辛教授大力支持和帮助。在2014年11月中旬，我们将稿件投稿到英文期刊Oncotarget（肿瘤标靶）。这本期刊在当时的影响因子（IF）为6.67， 也就是说如果能在该期刊发表文章，基本达到了一个博士生毕业的要求。

2015年1月，我们得到了编辑部的反馈。针对审稿人的意见，我们又一起进行实验的补充，修改意见的答复。比如审稿人要求证明丹参酮是否影响miR-32的转录因子调控？这其实这是个连锁问题：我们得先确定哪个转录因子，才能确定丹参酮对转录因子是有作用的。而且，这个作用与之前的实验结果必须要吻合。

于是，我和张同学一起分析这些问题。张同学说，她曾经在一篇文章中看到有介绍雄性激素（AR）作为转录因子的内容，我们可以试试AR，另外再确定另一个转录因子做备选。在接下来半个月时间内，她做出了实验结果，该结果也着实让人非常激动，它完全了符合我们的预期：丹参酮抑制了AR，这样一来miR-32表达水平上升，最后起到了抑制肺癌的作用。最后我们提出如下机理图， 这也是国际上首次从microRNA角度阐明中药组份丹参酮抑制肿瘤机理：

（Oncotarget，2015 Aug 21；6（24）：20111-20，DOI：10.18632/oncotarget.3933）

即丹参酮（Tanshinone）给药处理后，引起miR-32上升，miR-32抑制癌基因AURKA（图中）；初步验证丹参酮促进miR-34a表达上升，抑制癌基因TGFβ2（图右）。丹参酮促进let-7表达（图左）。这些都抑制了非小细胞肺癌肺癌（NSCLC）。

经过我们的再次修改，文章发出的第二天，主编就告知我们决定录用，这是最快的一种接受方式，说明我们的工作得到了最大的认可。2015年5月，文章在线发表。

2015年6月19日，是个让人紧张的日子，我指导的硕士研究生张冰洁同学要进行硕士论文答辩了。最终答辩取得非常好的效果，给来自中国科学院上海生化与细胞所及苏州医工所的专家们留下深刻的印象。这个来自上海大学的学生终于出色地毕业了，此刻，我心里终于踏实了，梦想也最终成为了现实。

致谢：感谢张冰洁同学（现供职于上海某大型药企）提供的资料。特别感谢李艳利老师，金由辛教授及课题组老师在学生培养过程给予的帮助。

责任编辑：曹晓晨