加系SPF大白猪和长白猪群体遗传学分析

贺希文，高彩霞，姜骞，权金强，蔡原*，曲连东*

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001)

研究报告

加系SPF大白猪和长白猪群体遗传学分析

贺希文1，2，高彩霞2，姜骞2，权金强1，蔡原1*，曲连东2*

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001)

目的研究中国农业科学院哈尔滨兽医研究所从加拿大引进的SPF大白猪和长白猪的遗传学背景。方法实验采用19对微卫星引物对该群体进行群体遗传学分析。结果19个位点在大白猪群中检测到84个等位基因，长白猪群中检测到89个等位基因。大白猪的平均多态信息含量和平均杂合度分别为0.5271和0.5877；长白猪的平均多态信息含量和平均杂合度分别为0.5652和0.6066。由于S0155、S0143、S0178、Sw857和Sw936位点内等位基因大小和含量差异显著（P＜0.01)可作为大白猪和长白猪品种鉴定的候选位点。F-统计和迁移率分析结果表明，群体内的分化较小，遗传结构稳定。结论引进加系SPF纯种大白猪和长白猪的遗传结构与国内部分纯种大白猪和长白猪相比更为稳定，可作为实验动物模型应用于动物医学和科学研究。

SPF猪；微卫星标记；实验动物；遗传多样性

当今世界大白猪和长白猪是最重要的商业品系肉用猪，尤其以生长速度快、繁殖力高、适应性强和瘦肉率高的特点而被人们所熟知，它是世界上最著名，分布最广的主导瘦肉型猪，全世界范围内均有饲养[1-3］。据调查，国内外很多特有小型猪，如广西巴马小型猪、西藏小型猪、甘肃蕨麻猪、Yucatan小型猪等，作为实验动物模型广泛应用于动物医学、科学研究、器官移植等诸多方面[4-7］；而长白猪，杜洛克和大白猪等为重要的肉用型品种多用于经济性状的选育和保种[8］，用于SPF级实验动物模型研究更是鲜有报道。而中国农业科学院哈尔滨兽医研究所从加拿大引进100头无猪瘟、猪呼吸综合征、猪传染性胃肠炎、猪流感等病原体的SPF猪主要应用于实验动物，其中大白猪和长白猪各50头包含32窝大白猪和28窝长白猪。随猪附赠系谱材料显示该种群可追溯至其10代以内的血缘关系，引进之后继续对它们进行封闭环境饲养，已繁育一代。运用微卫星标记技术检测两个种群的遗传多样性明确其遗传背景为实验动物化提供理论依据。现拟向哈尔滨市及周边多个猪场、科研机构和生物制药物企业提供标准的实验动物素材为猪病的研究和疫苗的制备提供良好的实验动物材料。

微卫星标记（microsatellite)，又称为短串联重复（short tandem repeats，STRs)或简单重复序列（simple sequence repeats，SSRs)，由2-6个核苷酸串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体和品种间呈高度变异而产生数量丰富的等位基因（或基因型)，广泛应用于动植物优良性状的选育和标记，如稻米的淀粉品质、猪的主要经济性状的选育与标记[9-11］。在家畜育种和亲子鉴定（包括个体来源、品种来源、个体或品种间的亲缘关系鉴定)[12-14］中有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

98份猪耳组织样本，引自加拿大，均来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牧场。其中大白猪和长白猪各49头，所采耳组织样品均置于无菌的1.5 mL EP管中带回实验室，-20℃冰箱保存备用。

1.2 实验试剂

2×Taq PCR Starmix聚合酶购自GenStar，小剂量基因组DNA提取试剂盒购自Axygen公司。引物根据联合国粮农组织（FAO)和国际动物遗传学会（ISAG)联合推荐的30对微卫星引物中，依据等位基因数的丰富程度、分布在不同染色体的原则，选取了其中的19个微卫星位点，实际实验扩增过程中部分位点的退火温度和扩增后分析范围进行微调（见表1)，由北京金唯智公司合成，其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 基因组DNA的提取

按照Axygen小剂量基因组DNA提取试剂盒说明书提取猪耳组织基因组DNA。将DNA溶于去离子水，用NanoDrop-100紫外分光光度计测定浓度和纯度，然后用去离子水稀释至 20 ng/μL，置于-80℃冰箱冻存备用。

1.4 PCR扩增与检验

根据扩增片段的理论值大小，每组位点中的片段大小相差至少10～25 bp，并且标记的荧光颜色不发生重叠，将19对微卫星引物分为6组。PCR反应体系为20μL:上、下游引物各1μL（10 mmol/L)，2 ×Taq PCR Starmix聚合酶10μL，模板DNA 1μL，ddH2O 7μL。反应条件为:94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃～65℃退火（分组及不同引物的Tm值见表1)30 s，72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃延伸7 min，10℃保存。扩增产物按组混合加样进行凝胶毛细管电泳检验，并用GeneMapper V4.0软件进行荧光数据提取、分子量标准设定和PCR产物片段大小的计算，最后根据核心碱基数完成基因型的判定。

1.5 统计分析

采用Excel Microsatellite Toolkit V3.1软件，计算大白猪和长白猪在19个微卫星位点上的等位基因数、杂合度、多态信息含量。利用Genepop V1.2软件进行群体间的遗传分化和基因型差异的分析[15］。利用FSTAT V2.9.3进行F-检验[16］。利用Structure V2.3软件分析大白猪和长白猪的遗传分化结构图，所设参数“Burnin Period”和“After Burnin”均为50 000次，K值为2-5，然后利用distructure软件显示图形。

表1 19对微卫星引物详细信息Tab.1 Detailed information of the 19 microsatellite loci primers

2 结果

2.1 扩增结果

PCR产物经2%的琼脂糖凝胶检测，扩增片段大小与预期结果相符（图1)。大白猪和长白猪在19个微卫星位点分别检测到84和89个等位基因，两群体共享57个等位基因，平均含有4.42和4.63个等位基因（表2)。19个位点中S0005位点等位基因最多有14个，Sw2406和S0218位点等位基因最少各3个（表3)。

2.2 等位基因和杂合度分析

19个微卫星位点的平均杂合度相对较高，其中长白猪略高于大白猪分别为0.6066和0.5877，均在0.5～0.7之间（表2)。大白猪群中S0005位点的杂合度最高为0.8395检测到杂合体43个，S0178位点的杂合度最低为 0.1515仅检测到 8个。Sw2406位点共检测到221、233、251 bp 3个等位基因，而251 bp等位基因仅存在于大白猪群中，在长白猪群中并没有检测到该等位基因，表明251 bp等位基因为大白猪特有的等位基因；长白猪S0178位点的杂合度最高为0.7570，S0218位点的杂合度最低为0.0204，在S0218位点仅检测到167 bp和169 bp两个等位基因而169 bp等位基因在长白猪群中只检测到一个。此外，Sw857 144 bp、Sw936 117 bp、S0143 168 bp、S0155 152 bp和S0178 109 bp这5个位点在两群体间的分布和含量差异极显著。结果表明相同位点的等位基因个数和杂合度在不同群体差异极显著。

表2 大白猪和长白猪两个群体在19个微卫星位点上的杂合度和多态信息含量Tab.2 Value of heterozygosities and polymorphism information content（PIC)in the pedigree Yorkshire and Landrace populations at19 microsatellite loci

图1 S0143位点扩增产物Fig.1 PCR amplification of the products of S0143 in agarose

2.3 多态信息含量

两个群体中S0005位点的多态信息含量最高为0.8102，S0178位点多态信息含量最低0.1387，大白猪和长白猪的平均多态信息含量分别为0.5271和0.5652。S0005、S0218、S0068、Sw2410、S0097、Sw122、Sw2406、S0355位点的多态信息含量在大白猪群普遍高于长白猪群，而其他11个位点则反之（表2)。19个微卫星位点中S0005位点的多态性信息含量最高为0.8696，Sw2406位点多态信息含量最低为0.3328，平均多态信息含量为0.6388（表3)。结果表明大白猪和长白猪两个群体间的平均多态信息含量差异无显著性（P＞0.05)，没有表现直接的线性关系。

2.4 F-统计和遗传结构分析

通过微卫星座位的F-统计以及Nm来检验群体间的遗传分化程度和迁移率（表3)。群体的固定指数Fst为0.0273-0.5218，均值为0.2145，而Fis和Fit指数有正有负，如 S0178、S0218、IGF1、S0228、S0355、Sw1067位点的Fis值均为正值，而Fit除了SOO68为负值外其他18个位点均为正值。Fis和Fit出现正值表明群体基因型分化显著。Nm为0.2291-8.9075，平均值为1.5320。Nm越小表明群体的遗传结构越相似。群体遗传结构分析表明，两猪群遗传分化结构稳定（图2)，一方面可能因为它们是纯系品种，另一方面则主要是因为两猪群在19个位点的等位基因较少，共享极为有限的等位基因。

表3 19个微卫星座位的杂合度，多态信息含量和F-统计Tab.3 The F-statistics and polymorphism information content（PIC)of the 19 microsatellite loci

图2 大白猪和长白猪的遗传结构Fig.2 Genetic structure of Yorkshire and Landrace pigs

3 讨论

3.1 群体的多样性

微卫星标记以其分析方法便捷、操作简单等优点，在亲子鉴定、辅助标记和群体遗传多样性等方面得到广泛应用。研究表明19个微卫星位点之间的多样性差异存在显著性（P＞0.05)，主要表现在相同位点的等位基因频率在大白猪和长白猪群体中的分布差异有显著性（P＞0.05)，如在S0178位点109 bp的等位基因在大白猪种群出现的频率最高，而长白猪种群在109 bp处等位基因仅检测到3个。其中19个位点特异性等位基因出现在长白猪群的频率较高。如S0178位点处121、123、125 bp等位基因，Sw936位点处117 bp等位基因，S0228位点处230和234 bp等位基因和S0155位点处152 bp等位基因仅在长白猪种群中被检测到，而Sw857位点处144 bp和S0143位点处168 bp等位基因仅在大白猪被检测到，可能与长白猪具有较高的杂合度有关。可将S0155、S0143、S0178、Sw857和Sw936位点作为长白猪和大白品种鉴定的候选微卫星位点。李何君等[17］和Costa等[18］分别应用12和14对微卫星引物对美系、英系、法系大约克夏猪群体和欧洲野猪进行品系鉴定及个体鉴定，鉴定正确率均为100%，本研究选取的5对候选品种鉴定引物均在两者的研究之列，说明该位点是准确、有效、可靠的品系鉴定位点。此外，分别对大白猪和长白猪群体的观测杂合度和期望杂合度进行卡方检验，表明两群体差异无显著性（P＞0.05)，符合封闭群条件（参照实验用小型猪遗传质量控制，北京地方标准: DB11/T 828.3 2011)。可从分子水平明确两种群的遗传背景，反映出大白猪和长白猪两群体之间的遗传差异并作为“活的仪器”广泛应用于病毒的感染实验，疫苗的检定和评价，为遗传保种和实验动物化提供良好的分子基础。

遗传多样性的衡量指标通常为群体的平均杂合度和多态信息含量，大白猪的平均多态信息含量和平均杂合度分别为0.5271和0.5877；长白猪的平均多态信息含量和平均杂合度分别为0.5652和0.6066。大白猪和长白猪两个品种的平均杂合度与平均多态信息含量与赵振华等[19］和巩元芳等[20］对国内大白猪和长白猪的研究结果相比较低，表明该种群与国内纯系品种相比人工选育的程度更高，遗传结构更趋稳定。此外，19个微卫星座位的平均杂合度比Li等[21］对台湾欧洲纯系品种猪的研究结果略高，表明它们的选育程度非常接近，遗传结构比较稳定，更适合选用于标准的实验动物材料。

3.2 群体的遗传分化与变异

Fis值和Fit值均有正有负，表明群体的等位基因和基因型分化显著，主要表现为相同位点的等位基因在不同品种间的分布差异显著（P＞0.01)。而Fst值表示群体间的分化程度，Fst的平均值为0.2145与赵振华等[19］和杨彤彤等[22］相比此次引进种群的分化程度显著（P＞0.01)低于国内部分纯种猪群[15］。Nm值越小表示群体间的遗传结构越相似，Nm的平均值为1.5320也显著（P＞0.01)低于杨彤彤等[22］对我国部分纯系猪的研究。与国内部分保存的纯系猪相比又一次证明了中国农业科学院哈尔滨兽医研究所引进的大白猪和长白猪两纯系种群群体内分化较小遗传结构稳定适合用于实验动物材料，这可能与该种群的长期人工选育有关。

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Analjsis of the pedigreed population genetics of SPF Yorkshire and Landrace pigs im ported from Canada

HE Xi-wen1，2，GAO Cai-xia2，JIANG Qian2，QUAN Jin-qiang1，CAIYuan1*，QU Lian-dong2*
（1.College of Animal Science and Technology of Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070，China. 2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS)，Harbin 150001)

ObjectiveTo understand the genetic background of the specific pathogen-free Yorkshire and Landrace pigs，imported from Canada by Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences.MethodsThe population genetics were investigated by using 19 pairs ofmicrosatellite primers.ResultsIn the Yorkshire pigs and Landrace pigs，84 and 89 alleles，respectively，were detected at19 microsatellites loci.The average polymorphic information content and mean heterozygosity in the Yorkshire pigs were 0.5271 and 0.5877，and in the Landrace population were 0.5652 and 0.6066，respectively.Because of the significant（P＜0.01)differences of alleles in different loci such as S0155，S0143，S0178，Sw857 and Sw936，itmade them possible to be used to identify Yorkshire and Landrace pigs＇breed. F-statistics showed that the differentiation within the population was small and genetic structure was stable.ConclusionsCompare with the domestic pedigree largeWhite and Landrace pigs，the SPF pedigree pigs imported from Canada aremore stable in genetic structure，and can be used as laboratory animalmodels in animal science research.

Specific pathogen-free pigs；Microsatellite；Laboratory Animal；Genetic diversity

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0551-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.001

2015-09-28

国际科技合作计划项目（2010DFB33620)；哈尔滨市青年科技创新人才专项资金项目（2013RFQYJ043)。

贺希文（1987-)，男，硕士研究生，专业:动物遗传育种与繁殖，E-mail:hexiwenso@163.com

蔡原，副教授，研究方向:动物遗传育种与繁殖.E-mail:caiyuan@gsau.edu.cn

曲连东，研究员，研究方向:分子病毒学与动物疫病诊断学.E-mail:qld@hvri.ac.cn