食蟹猴SPF种群建立过程中病毒抗体的动态监测

王宏，韦秋奖

（1.云南中科灵长类生物医学重点实验室，昆明 650550；2.昆明亚灵生物科技有限公司，昆明 650550；3.昆明理工大学灵长类转化医学研究院，昆明 650500)

研究报告

食蟹猴SPF种群建立过程中病毒抗体的动态监测

王宏1，3，韦秋奖1，2

（1.云南中科灵长类生物医学重点实验室，昆明 650550；2.昆明亚灵生物科技有限公司，昆明 650550；3.昆明理工大学灵长类转化医学研究院，昆明 650500)

目的调查从老挝引种的食蟹猴BV、SRV、SIV和STLV-1四项病毒抗体阳性、可疑的比例，并对SPF种群建立过程中四项病毒的动态变化进行了监测，进而比较普通种群和SPF种群幼猴病毒抗体的阳性率。方法采用专用试剂盒对四项病毒进行连续监测并进行比较分析。结果引种的1998只食蟹猴，BV抗体阳性比例高达52.35%，可疑比例为8.31%，抗体阴性的比例仅为39.34%；SRV和STLV-1抗体阳性率分别为7.45%和8.56%；未检测出SIV抗体阳性或可疑的食蟹猴。经过筛选后组建的SPF种群，2010年监测的BV、SRV和STLV-1三项病毒抗体阳性率分别为5.24%、1.01%和0.4%，经过连续5年的不断筛选和淘汰，截至2014年年底三种病毒抗体阳性率分别下降至0.82%、0.27%和0.27%，未监测出SIV抗体阳性或可疑的食蟹猴。普通群繁殖幼猴B病毒抗体阳性的比例为9.71%，可疑率为1.85%；而SPF繁殖种群B病毒抗体阳性率仅为0.22%。结论连续监测病毒抗体并不断淘汰抗体阳性和可疑的动物对组建SPF食蟹猴种群具有重要的生产意义。

食蟹猴；SPF种群；BV抗体；SRV抗体；STLV-1抗体；SIV抗体；抗体监测

非人灵长类动物是人类的近亲，与人的遗传相似性极高，具有许多与人类类似的生物学和行为学特征，在组织结构、生殖生理学、解剖学上与人类高度相似[1，2］。近年来，随着生命科学的快速发展，对非人灵长类动物的需求一直在持续增加，扩大非人灵长类动物种群数量，获得高质量、标准化的非人灵长类实验动物已成为我国科学研究进一步发展的迫切需求。目前，国际上对 SPF（specific pathogen free)级猕猴的定义主要是指动物体内不含猴B病毒（cercopithecine herpesvirus type I，BV)，猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV)，猴T细胞趋向性病毒 I型（simian T lymphotropic virus type I，STLV-1)，猴逆转D型病毒（simian retrovirus，SRV)和猴痘病毒（simian pox virus，SPV)等几种特定病毒的猕猴。由于非人灵长类动物可能会自然携带或感染多种病毒，因此在建立SPF种群的过程中对病毒抗体的监测就显得极其重要，并直接影响建群的成功率。本研究对昆明某猴场的食蟹猴进行了长期、大规模的病毒监测，在此基础上不断地筛选和剔除病毒抗体阳性和可疑的动物，从而稳定SPF种群的建立，进一步促进我国SPF级非人灵长类实验动物事业的发展。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样本收集

供试食蟹猴于2009年均从老挝引种至昆明亚灵生物科技有限公司【SCXK（滇)2010-0001】。其中雄性食蟹猴998只，雌性食蟹猴1000只，年龄均在3～5岁之间。2009年SPF食蟹猴初始种群建立时，对BV、SRV、SIV和STLV-1 4种病毒进行连续4次的病毒抗体检测，每次间隔时间2个月。从2010年、2011年、2012年、2013年和2014年，每年两次对动物检测BV、SRV、SIV和STLV-1 4种病毒，间隔时间为每6个月一次【SYXK（滇)2010-0001】。食蟹猴饲养的设施及管理规范已通过国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International)的完全认证。

1.2 被检血清

静脉采集全血2 mL，静置30 min后离心（3000 r/min×15 min，室温)，分离血清静置于4℃待检，若长期保存，需置于-40℃冰箱冷冻保存。

1.3 检测试剂盒

猴5项病毒斑点免疫检测试剂盒均从VRL Laboratories（USA)购买，实验操作步骤按照试剂盒说明进行。

1.4 结果判定

根据试剂盒说明判断病毒抗体阳性、可疑和阴性，可疑结果经过1个月后重新采样复检予以确认。

2 结果

2.1 引进初始种群时病毒抗体检测结果

对2009年从老挝引种的食蟹猴，经连续进行4次病毒抗体检测后，结果显示，在1998只动物中，BV抗体阳性食蟹猴总比例高达52.35%，其中仅B病毒抗体阳性的食蟹猴比例为48.95%，同时检测出BV和SRV抗体阳性的比例为1.30%，BV和STLV-1抗体同时表现阳性的比例为1.50%，同时检测出BV、SRV和STLV-1 3种病毒抗体均为阳性的食蟹猴比例为 0.60%；BV抗体可疑的比例为8.31%，而在引进的1998只食蟹猴中，BV抗体检测为阴性的比例仅为39.34%。在检测的血清样本中，SRV和 STLV-1抗体阳性率分别为7.45%和8.56%。通过血清样本检测，未检测出SIV抗体阳性或可疑的动物，具体检测结果见表1和图1。

2.2 BV抗体动态监测结果

结果显示，BV抗体阳性食蟹猴数量每年呈逐渐下降的趋势，2010年BV抗体阳性率和可疑率分别为5.24%和1.61%，截至2014年年底，BV抗体阳性率仅为0.82%，BV抗体可疑动物比例仅为0.55%，具体检测结果见表2。

2.3 SRV抗体动态监测结果

结果显示，SRV抗体阳性动物数量从2010～2014年每年呈逐渐下降的趋势，2010年SRV抗体阳性的食蟹猴为5只，阳性率为1.01%，SRV抗体可疑的食蟹猴为3只，可疑率为0.60%，截至2014年年底，SRV抗体阳性的食蟹猴仅为1只，SRV抗体可疑食蟹猴也仅有1只，具体检测结果见表3。

2.4 STLV-1抗体动态监测结果

结果显示，STLV-1抗体阳性动物数量从2010～2014年的变化趋势不明显，2010年STLV-1抗体阳性的食蟹猴有2只，而2014年STLV-1抗体阳性的食蟹猴仍然有1只。具体检测结果见表4。

表1 引进初始种群时病毒抗体检测结果Tab.1 Results of virus antibody test of the introduced initialmonkey population

图1 引进初始种群时病毒抗体阳性与可疑率Fig.1 Positive and suspicion rate of virus antibody of the introduced initialmonkey population

表2 BV抗体动态监测结果Tab.2 Results of dynamic monitoring of BV antibody

表3 SRV抗体动态监测结果Tab.3 Results of dynamic monitoring of SRV antibody

表4 STLV-1抗体动态监测结果Tab.4 Results of dynamicmonitoring of STLV-1 antibody

2.5 SIV抗体动态监测结果

从2009年引种至2014年年底，每年均按程序对食蟹猴进行SIV抗体监测，结果显示，均未检测出SIV抗体阳性或可疑的食蟹猴。

2.6 SPF种群与普通种群自繁幼猴病毒抗体比较

从2009年初步建立SPF种群后，于2012年开始配种繁殖，根据2012年、2013年和2014年的繁殖情况分析，普通种群共繁殖865只幼猴，SPF种群共繁殖462只幼猴，幼猴断奶时间为5～8个月，幼猴断奶时采集血样并对病毒抗体进行检测。病毒抗体检测结果表明，普通种群繁殖的幼猴中，BV抗体阳性的幼年食蟹猴共84只，阳性率为9.71%，BV抗体可疑动物16只，可疑率为1.85%；而检测SPF繁殖种群的462只幼猴发现只有1只幼猴检测BV抗体表现阳性，阳性率仅为0.22%，未发现BV抗体可疑的动物。同时对SPF种群与普通种群自繁幼猴病毒检测中均未发现SRV、SIV、STLV-1抗体阳性或可疑的动物，结果见表5。

表5 SPF种群与普通种群幼猴病毒抗体比较Tab.5 Comparison of virus antibody in the babymonkeys of the common and SPF populations

3 讨论

本研究涉及食蟹猴数量较多，时间跨度大，年龄段较为集中，从最初组建SPF种群的检测结果来看，BV抗体阴性的食蟹猴比例仅为39.34%，抗体可疑的比例为 8.31%，而 BV抗体阳性率高达52.35%，略高于赵国明等[3］调查显示来自广西各野生动物保护区食蟹猴B病毒相关抗体阳性率49.8%，但低于韦毅等[4］报道的野外捕获混养食蟹猴B病毒83.4%的阳性率，数据表明BV在食蟹猴养殖中普遍存在且病毒抗体阳性率高。

对2009年引种的食蟹猴进行连续4次检测统计，SRV和STLV-1抗体阳性率分别为7.45%和8.56%，SRV和STLV-1抗体阳性率分别高于杨净思等[5］报道的恒河猴SRV和STLV-1的抗体阳性率（分别为5.36%和5.95%)，也高于饶军华等[6］报道食蟹猴的STLV-1抗体5.4%的阳性率，但低于周亚敏等[7］报道食蟹猴STLV-1抗体14.9%的阳性率及SRV抗体18.1%的阳性率，经过筛选后组建的SPF种群，在2010年检测的BV、SRV和STLV-1抗体阳性率分别为5.24%、1.01%和0.4%，经过连续5年的不断筛选和淘汰，BV、SRV和STLV-1抗体阳性率在2014年年底分别下降至0.82%、0.27%和0.27%，说明连续监测病毒抗体并不断淘汰抗体阳性和可疑的动物对组建SPF食蟹猴种群具有重要意义。

通过对SPF种群与普通种群自繁幼猴病毒抗体比较分析发现，普通种群繁殖的幼猴中，BV抗体阳性的幼年食蟹猴共84只，阳性率为9.71%，可疑率为1.85%，其中原因可能与幼猴从出生到离乳期间，生存的环境中都是BV抗体阳性或可疑猴，增加了感染机率；而检测SPF繁殖种群的462只幼猴发现只有1只幼猴检测BV抗体表现阳性，阳性率仅为0.22%，未发现BV抗体可疑的动物，说明了在SPF食蟹猴种群的建立过程中，定期对动物病毒进行监测，隔离阳性和可疑的动物，对提高食蟹猴的质量具有重要意义，同时也表明了SPF种群建立对生产SPF幼猴具有显著的意义。

李常挺等[8］报道过野生猕猴SIV抗体全部呈阴性，本文通过对食蟹猴SIV抗体的连续监测，也均未发现SIV抗体阳性或可疑的食蟹猴，提示从老挝引种的食蟹猴不携带SIV。

通过对老挝引种的食蟹猴病毒抗体的监测结果提示，我国在引进食蟹猴时，应该注意:（1)重视加强对食蟹猴BV、SRV、STLV-1抗体的监测；（2)通过数据显示，应尽量引进年幼的动物，这与刘欢等[9］的研究结果一致。

现有的研究结果普遍认为灵长类动物病毒的主要传播途径包括打斗、撕咬、性交等，母猴垂直传播给仔猴几率极低[10，11］，同时韦秋奖[12］对137份 B病毒阴性群自繁1岁以上的幼猴血清进行检测，没有发现B病毒抗体呈阳性。因此在灵长类动物日常饲养过程中，除了加大对阳性和可疑动物监测和淘汰力度外，必须加强防御措施，包括饲养环境的标准化、不断完善检疫制度以及人员的管理等。首先，引进灵长类动物时，必须隔离检疫，检测合格后方可进入饲养区；其次，按饲养目的的不同，采取分群饲养管理，加强对食物和饲养环境的消毒，发现阳性和可疑动物严格隔离处理。第三，建立完善的检疫制度，定期对整个猴群进行病毒抗体的检测，严格淘汰阳性和可疑动物，逐渐建立SPF种群。

[1］ 魏振年.猕猴的生殖生理及科研应用 [J］.动物学杂志，1988，23（6):46-50.

[2］ 林昆华.灵长类动物疾病学 [M］.北京:农业大学出版社，1994，231-232.

[3］ 赵国明，麻秀珍，王弘义，等.广西食蟹猴B病毒感染情况调查[J］.中国检验检疫，1997，14（5):26-27.

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[5］ 杨净思，张丽旌，李晓燕，等.恒河猴SRV-1和STLV-1血清抗体流行病学研究 [C］.第十次全国生物制品学术会议，2009，311-314.

[6］ 饶军华，刘晓明，金石军，等.猕猴、食蟹猴群中STLV-1病毒感染状况的研究 [J］.实验动物科学与管理，2004，21（4):25-26.

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[12］ 韦秋奖.自繁幼猴感染B病毒情况调查 [J］.实验动物科学，2013，30（4):53-55.

Djnam ic monitoring of virus antibodj during the establishment of SPF cjnomolgusmonkej population

WANG Hong1，3，WEIQiu-jiang1，2
（1.Yunnan Key Laboratory of Primate Biomedical Research，Kunming 650550，China；2.Kunming Biomed International，Kunming 650550；3.Institute of Primate Translational Medicine，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500)

ObjectiveTo investigate the positive and suspicious rates of BV，SRV，SIV and STLV-1 antibody of the cynomolgusmonkeys introduced from Laos，dynamicmonitoring of virus antibody during the establishmentof SPF cynomolgusmonkey population，and then comparing the positive rate of virus antibody in the babymonkeys between the common with SPF populations.MethodsContinuousmonitoring four kinds of virus in themonkeys was carried out using special reagent kits and analyzed the data.ResultsIn the introduced cynomolgusmonkeys（n=1998)，the positive rate of BV antibody was 52.35%，suspicious rate of BV antibody was 8.31%，and negative rate of BV antibody was only 39.34%，the positive rates of SRV and STLV-1 antibody were 7.45%and 8.56%，respectively，and positive or suspicious SIV antibody in the cynomolgusmonkeyswas not detected.After screening and establishment of the SPF population，the positive rates of BV，SRV and STLV-1 antibody were 5.24%，1.01%and 0.4%，respectively，in the year 2010.Then after five years of screening and elimination，by the end of 2014，the positive rates of BV，SRV and STLV-1 antibodies were 0.82%，0.27%and 0.27%，respectively，and positive or suspicious SIV antibody in the cynomolgusmonkeyswas notdetected.The BV antibody positive rate of the babymonkeyswas 9.71%and the suspicious rate was 1.85%in the commonpopulation，but only 0.22%of the baby monkeys in the SPF population.ConclusionsContinuousmonitoring virus antibodies and eliminating positive and suspicious animals have important significance in the establishmentofa SPF cynomolgus monkey population.

Cynomolgusmonkey；SPF population；BV antibody；SRV antibody；STLV-1 antibody；SIV antibody；Antibodymonitoring

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0573-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.005

2015-07-23

云南省技术创新人才项目（编号:2014HB090)；昆明市科技计划项目（编号:2014-04-A-S-02-3074)；云南省技术创新项目（编号:2015XA33)。

王宏（1975-)，男，硕士，副研究员，研究方向:实验动物学与人类疾病动物模型研究。Email:wangh@kbimed.com