去卵巢法骨质疏松树鼩模型的建立

王运林，匡德宣，马朝霞，王娅娟，张利东，高斌，徐显鑫，胡敏*，段宜强*

（1.贵州医科大学，贵阳 550025；2.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心，昆明 650118；3.昆明学院，昆明 650214；4.昆明医科大学，昆明 650500)

研究报告

去卵巢法骨质疏松树鼩模型的建立

王运林1，匡德宣2，马朝霞3，王娅娟3，张利东3，高斌3，徐显鑫4，胡敏3*，段宜强1*

（1.贵州医科大学，贵阳 550025；2.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心，昆明 650118；3.昆明学院，昆明 650214；4.昆明医科大学，昆明 650500)

目的采用手术双侧卵巢去势法复制人绝经后骨质疏松树鼩模型。方法100只雌性树鼩纳入实验，参照中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会2011年发布的《原发性骨质疏松症临床诊疗指南》（以下简称《指南》)诊断标准进行模型评价:①根据人自然寿命、性成熟时间、骨密度（BMD)峰值年龄及树鼩自然寿命、性成熟时间，推测树鼩BMD峰值月龄。随机抽取6、12、18、24月龄树鼩各6只行全身BMD检测，比较各月龄段BMD差异，验证树鼩BMD峰值月龄；②从余下的树鼩中随机抽取BMD峰值月龄段树鼩62只行BMD检测，确定树鼩BMD峰值均数与标准差。然后将其随机分为模型组（n=32)与空白组（n=30)，模型组手术切除双侧卵巢，空白组切除与卵巢等体积的大网膜，各组分别于术后3、6、9、12月时随机抽取6只行BMD检测，对BMD值符合《指南》诊断标准者取材行病理检测验证。结果①6、12、18、24月龄段受测树鼩BMD峰值分别为（0.138±0.012)、（0.143 ±0.010)、（0.141±0.009)、（0.139±0.009)g/cm2，各月龄树鼩BMD峰值差异无显著性（P＞0.05)；②树鼩BMD峰值均数为（0.143±0.016)g/cm2；③模型组各时相点BMD值符合《指南》诊断标准的树鼩的数量分别为0、5、4、5只，其胫骨近端病理切片与6月龄树鼩比较:骨小梁稀疏、断裂，小梁间距增宽；空白组各时相点BMD值符合《指南》诊断标准的树鼩数量均为0，其胫骨近端病理切片与6月龄树鼩比较无异常。结论按《指南》诊断标准判断，6月龄雌性树鼩行双侧卵巢去势术后6月可复制出人绝经后骨质疏松模型，造模成功率较高，模型稳定。

树鼩；卵巢切除术；骨质疏松；骨密度；石蜡病理检查

目前，用于骨质疏松（osteoporosis，OP)造模的动物有:大鼠、兔、犬、羊和非人灵长类动物等[1-3］，OP模型中广泛使用的动物是大鼠，但大鼠缺乏哈弗氏系统[4］；兔具有哈弗氏系统，但松质骨含量少，对检测带来一定困难[5］；犬的雌激素分泌水平明显低于人类，卵巢和子宫切除不会诱发明显的骨丢失[6］。非人灵长类动物可较好地复制人类OP模型，但饲养困难、体型大、成本高、实验周期长，因而使用受到限制[7］。故采用上述动物复制的人类OP模型均存在一定不足。云南省重点开发的实验动物树鼩是攀鼩目树鼩科动物，其大拇指（趾)与其他指（趾)分开、胫骨与腓骨独立、牙齿具有前臼齿等特征；月经周期为（26.5±8.3)d[8］，与人相似；全基因组测序发现其比小鼠、大鼠、犬等与人有更高的同源性[9］，与目前常用的非人灵长类动物相比，具有体型小，易于饲养，繁殖率高，成本低等优点，适合于人绝经后OP模型的研究。本研究采用手术双侧卵巢去势法复制绝经后OP树鼩模型，拟为OP的研究提供新型动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器

盐酸塞拉嗪注射液（1.5×10-3L:0.03 g，聖鑫)；盐酸苯噁唑注射液（2×10-3L:0.03 g，聖鑫)；双能X线骨密度测量仪（Prodigy Advance型，美国GE-Lunar公司)；显微镜（Nikon Eclipse Ci-E，日本)；电脑超薄切片机（KD-3358，Kedee)。

1.1.2 实验动物

100只滇西亚种雌性树鼩，体重（128.603± 5.997)g，6～24月龄，实验所用树鼩均由中国医学科学院生物医学研究所提供【SCXK（滇)K2013-0001】；实验在昆明学院分子医学研究中心【编号: SYXK（滇)K2014-0002】进行。运输应激反应及麻醉意外共死亡14只。

1.2 方法

1.2.1 确定滇西亚种雌性树鼩 BMD峰值均数与标准差

（1)确定滇西亚种雌性树鼩BMD峰值取样个体月龄:根据中国女性性成熟年龄18岁[10］，女性人均期望寿命76.7岁[11］，女性 BMD峰值年龄30岁左右[12］；雌性树鼩性成熟年龄 6月，与雌性树鼩自然寿命8～12岁[13］；推算树鼩BMD峰值月龄。

（2)抽样验证滇西亚种雌性树鼩BMD峰值:随机抽取6、12、18、24月龄雌性树鼩各6只行 BMD检测，LSD-t检验比较不同月龄树鼩间的BMD峰值差异，验证滇西亚种雌性树鼩BMD峰值适宜的取样月龄。

（3)确定本研究中滇西亚种雌性树鼩 BMD峰值均数与标准差:随机抽取BMD峰值月龄雌性树鼩62只行BMD检测，计算其均数与标准差，以此作为滇西亚种雌性树鼩BMD峰值均数与标准差。

1.2.2 造模动物与分组

随机选取适龄BMD峰值月龄雌性树鼩62只，随机分为模型组（n=32)与空白组（n=30)。臀肌注射盐酸塞拉嗪注射液（注射剂量:0.2×10-3L/ 100 g)麻醉后，无菌条件下取腹正中切口，进入腹腔。模型组动物均切除双侧卵巢，空白组动物均切除与卵巢等体积的大网膜。术后立即注射盐酸苯噁唑注射液（注射剂量:0.4×10-3L/100 g)，保温，常规饲养，严密观察进食、活动、掉毛、患病以及死亡情况，并记录。两组动物均于术前、术后3、6、9、12个月各随机抽取6只行BMD检测；BMD值符合《指南》[14］诊断标准者即时取材病理检测。

1.2.3 检测方法

（1)骨密度（BMD)检测:测量参数:电压76.0 kV；电流0.150 mA；时间63 s；辐射剂量0.20 mrem。

（2)骨组织形态学观察:实验动物臀肌注射大量盐酸塞拉嗪注射液安乐死后，取右侧胫骨近端0.2 cm置于4% 多聚甲醛溶液中固定24 h，磷酸盐缓冲液冲洗后再置于25% 甲酸中浸泡脱钙，3 d后取出脱水。石蜡切片、苏木精-伊红（HE)染色，显微镜下观察骨组织形态。

1.3 统计学分析

应用SPSS 20.0软件对所得数据进行单因素方差分析，计算结果以（±s)形式表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 树鼩的一般状况

造模前及空白组树鼩毛发光洁，活动体态正常；模型组逐渐出现反应迟钝，活动迟缓，毛色无光泽、稀疏、脱落。

2.2 确定本研究滇西亚种雌性树鼩BMD峰值

推算出滇西亚种雌性树鼩BMD峰值月龄为10.8月；6、12、18、24月龄段受测树鼩BMD峰值分别为（0.138±0.012、0.143±0.010、0.141±0.009、0.139±0.009)g/cm2，6、12、18、24月龄段雌性树鼩BMD峰值差异无显著性（P＞0.05)；62只6月龄雌性树鼩BMD值为（0.143±0.016)g/cm2，见表1；据此确定本研究中滇西亚种雌性树鼩BMD峰值为（0.143±0.016)g/cm2。

表1 62只6月龄雌性树鼩BMD（g/cm2)值Tab.1 The value of BMD from 62 6-month-old female tree shrews（g/cm2)

2.3 造模结果

2.3.1 造模动物的BMD检测结果

两组树鼩BMD值随时间变化情况见图1，模型组BMD逐渐降低，6个月时最明显，且一直持续到12月；空白组在正常范围内波动。按《指南》标准判断（骨密度降低程度等于和大于同性别、同种族正常成人的骨峰值2.5个标准差为骨质疏松)，双侧卵巢去势术后3、6、9、12个月时成模树鼩数量分别为0、5、4、5只，造模成功率分别为0%、83%、66%、83%；空白组各时相点BMD值符合《指南》诊断标准的树鼩数量均为0，见表3。

图1 各时相点树鼩全身BMD变化Fig.1 Changes of total body BMD of the tree shrews at different time points

表2 各时相点造模结果（n=6)Tab.1 The results ofmodeling at different time points

2.3.2 光镜观察结果

普通光镜100倍下观察，6月龄雌性树鼩骨小梁排列均紧密，小梁宽厚、间距小，小梁之间连接丰富，骨髓细胞多，脂肪空泡少。造模后6个月时，空白组与造模前比较无明显差异；模型组骨小梁数量显著减少，排列稀疏，小梁断裂，骨髓细胞减少，脂肪空泡多，与造模前及空白组相比较差异有显著性，见图2。

图2 树鼩胫骨近端病理切片HE染色观察（×100)Fig.2 Histological changes of the proximal tibia of tree shrews（HE staining，×100)

3 讨论

骨质疏松患病率随着人口老龄化而逐年增加[15］。目前我国OP患者近7000万人，其中绝经后OP患者约占80%，且发病机理尚不完全清楚，现有防治策略效果有限[16］。动物模型是进行绝经后OP基础与临床研究的基础[17］。双侧卵巢去势法是最常用的研究绝经后OP的造模方法，其优点是可较好地模拟绝经后OP的病理生理状态，造模成功率高、稳定性可靠、重复性好、适用范围广[18］。本研究证实了采用手术双侧卵巢去势法复制人类OP树鼩模型，具有较高的成模率；动物成模后动态监测BMD提示此OP模型具有较好的稳定性。

评价OP动物模型的指标主要有BMD、超微螺旋CT、骨组织形态学、生化指标和生物力学等，其中双能X线吸收法是诊断OP的“金标准”[19］，骨组织形态学检测可直观地观测与评价OP的程度。故本研究采用BMD与骨组织形态学相结合的方法评价OP树鼩模型，两种检测方法互为补充，结果吻合度高，方便快捷，可较好满足本研究实验设计需求。

目前文献常以造模后相同时相点模型组与空白组BMD值的差异是否具有统计学意义为评价OP动物模型的标准，其优点是实验体系相对封闭，直接进行模型组与空白组之间的比较，方便快捷；缺点是结果判断以参照组的BMD值为标准而非以种群的BMD峰值为标准，设计理念与《指南》规定的人类临床诊断标准不尽相符。本研究中，组织学检测结果证明参照《指南》标准评价树鼩OP模型可较好地反映OP的疾病特征。

以《指南》诊断标准为依据，以 BMD与组织学检测为主要评价手段，6月龄雌性树鼩行双侧卵巢去势术后6个月能成功建立OP模型，且具有造模成功率高、模型稳定的优点。由于树鼩是近年开始发展的实验动物，尚缺乏必要的基础数据，遗传背景不完全清楚，尚未标准化规模化饲养，可纳入实验的树鼩数量过少，因而本研究结果尚缺乏广泛的代表性。

[1］ 张月峰，韩景献.骨质疏松动物模型研究进展 [J］.动物医学进展，2005，26（3):8-11.

[2］ 徐洪璋，余斌.骨质疏松症动物模型研究现状[J］.第一军医大学学报，2002，22（1):47-50.

[3］ 丁桂芝，周勇.骨质疏松症研究中动物模型的选择与应用[J］.中国骨质疏松杂志，1997，3（3):84-88.

[4］ Ke HZ.Animal models for osteoporosis research[J］.Bone，2010，47（Suppl3):349-350.

[5］ 廖慧娟，廖二元.骨质疏松症动物模型[J］.国外医学内分泌学分册，2004，24（1):60-62.

[6］ 李素萍.骨质疏松动物模型的研究现状 [J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（20):3767-3770.

[7］ Jerome CP，Peterson PE.Nonhuman primate models in skeletal research[J］.Bone，2001，29（1):1-6.

[8］ 吴强，刘棒深，刘玲玲，等.树鼩血浆生殖激素初步研究[J］.上海实验动物科学，1989，9（3):140-141.

[9］ Yu F，Huang ZY，Cao CC.et al.Genome of the Chinese tree shrew[J］.Nature Comm，2013，4（2):66-78.

[10］ 谢幸，苟文丽.妇产科学[M］.第八版.中国:人民卫生出版社，2013:14.

[11］ Khalid M.Human Development Report 2014[M］.USA，The United Nations Development Programme，2014:177.

[12］ 全国十三省市骨矿含量调查合作组.骨骼生长衰老规律和原发性骨质疏松症预诊的研究[J］.中国骨质疏松杂志，1995，1（1):1-7.

[13］ Hubrecht R，Kirkwood J.The UFAW handbook on the care and management of laboratory and other research animals:Tree shrew [M］.Eighth Edition.Singapore:Robert Hubrecht and James Kiskwood，2009:262-275.

[14］ 中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会.原发性骨质疏松症诊治指南（2011年)[J］.中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2011，4（1):2-17.

[15］ Rejinster JY，Burlet N.Osteoporosis:A still increasing prevalence[J］.Bone，2006，38（2):4-9.

[16］ 吴海洋，索欢，王平.绝经后骨质疏松症的临床中药治疗进展[J］.中国骨质疏松杂志，2015，21（2):241-244.

[17］ Turner AS.Animalmodels of osteoporosis—necessity and limitation[J］.Eur Cells Mat，2001，1:66-81.

[18］ 程群，朱汉民.建立骨质疏松动物模型的标准化问题 [J］.老年医学与保健，2003，9（2):122-124.

[19］ Link TM.Osteoporosis imaging:state of the art and advanced Imaging[J］.Radiology，2012，263:3-17.

Establishment of an osteoporosismodel in tree shrews bj bilateral ovariectom j

WANG Yun-lin1，KUANG De-xuan2，MA Zhao-xia3，WANG Ya-juan3，ZHANG Li-dong3，GAO Bin3，XU Xian-xin4，HU Min3*，DUAN Yi-qiang1*
（1.Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China；2.Center of Tree Shrew Germplasm Resources，Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Kunming 650118；3.Kunming University，Kunming 650214；4.Kunming Medical University，Kunming 650500)

ObjectiveTo establish an osteoporosis model in tree shrews by bilateral ovariectomy.Methods One hundred healthy 6-24month old female tree shrewswere used in this study.The diagnosis and treatmentofosteoporosis in themodel tree shrewswas assessed according to the Interpretation of the Clinical Practice Guideines for Primary Osteoporosis 2011 released by the Chinese Medical Association of Osteoporosis and Bone Mineral Salt Disease Branch.① According to the human natural life span，sexualmaturation time and peak bonemineral density（PBMD)and the tree shrew natural life span and sexualmaturation time，we estimated the PBMD of tree shrew in the age ofmonths.Six 6-，12-，18-and 24-month old tree shrews in each group were randomly taken formeasurement of BMD，and compared the differences between groups to verify the PBMD age of tree shrews.②We chose 62 6-month old tree shrews from the restof tree shrews tomeasure their BMD to determine themean and standard deviation of BMD.Then we divided them into study group（n= 32)and control group（n=30).Bilateral ovariectomy was performed in the study group，while omentectomy was done in the control group.BMD wasmeasured at3，6，9，12 months after the surgery，6 animals from each group.The animals which met the criteria of guideline were taken for pathological examination.Results①The PBMD of6-，12-，18-，24-month old tree shrews was 0.138±0.012，0.143±0.010，0.141±0.009，and 0.139±0.009)g/cm2，respectively，showing no significant differences among them（P＞0.05).②Themean PBMD of the tree shrews was 0.143±0.016 g/ cm2.③In themodel groups，the number of tree shrewswhose BMDmet the criteria of guideline was0，5，4，5，respectively.The pathological examination of the proximal tibia from themodel group showed sparse and some disrupted trabeculae and enlarged inter-trabecular space.In the control group，the tibia tissues showed normal histology of bone structure and no one tree shrew showed a BMD value whichmet the criteria of diagnosis of osteoporosis.Conclusions An osteoporosismodel in tree shrews can be established at6 months after bilateral ovariectomy，showing similarmanifestation of osteoporosis in postmenopausalwomen.The success rate of thismodelingmethod is high and themodel is stable.

Tree shrew；Ovariectomy；Osteoporosis；Bonemineral density；Pathology

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0562-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.003

2015-09-24

国家科技支撑计划项目子课题（2014BAI01B01)。

王运林（1988-)，男，硕士生，研究方向:骨关节，E-mail:185281780@qq.com。

段宜强，副主任医师，研究方向:骨关节，手显微，E-mail:784853938@qq.com。胡敏，教授，主要研究方向:骨科基础与临床，E-mail:576794680@qq.com。