涂杜,徐志宏,张名位,张瑞芬,邓媛元*
(1.广东省农业科学院动物卫生研究所,广东省兽医公共卫生公共实验室,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,广州 510640;2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,农业部功能食品重点开放实验室,广州 510610)
肠黏膜屏障损伤是肿瘤患者化疗过程中常见的并发症[1]。化疗药物尤其是大剂量化疗药物可对胃肠道造成损伤,引起恶心、呕吐、腹泻、食欲减退等一系列胃肠道症状,严重影响患者化疗进程以及疾病预后[2-3]。为了评价机体在化疗过程中由于肠黏膜损伤引起的代谢、营养、免疫等多方面的生理病理改变,为合理的营养膳食和药物治疗提供指导,建立合适的化疗型肠黏膜损伤动物模型显得尤为重要。
化疗造成的肠黏膜炎动物模型的建立以前已有报道,其方法为一次性腹腔注射大剂量(20 mg/kg)MTX造成大鼠肠黏膜损伤。Mehmet等[4]研究发现20 mg/kg MTX可导致Wistar大鼠小肠黏膜损伤严重。该方法造成的肠黏膜损伤为急性损伤,持续时间一般为4~5d,之后逐渐恢复,也有部分动物在该过程中因损伤严重造成死亡。该模型展现了化疗造成的肠黏膜损伤的典型发病特征,主要用于评价短期内作用显著的化学药物或单一营养素的治疗效果,但不适合中长期营养支持的整体效果评价。化疗是间歇性用药的周期过程,在化疗期间给予患者全面的肠内营养支持不仅可以恢复肠道功能、维护肠黏膜屏障功能,对于加强机体免疫能力和促进康复也有积极作用。为了更好的模拟化疗进程,评估中长期营养支持对化疗造成的肠黏膜炎康复促进作用,本研究以SD大鼠(Sprague-Dawley rats)为实验动物,建立一种大鼠持续性肠黏膜损伤模型,以达到损伤持续周期长、不会因用药剂量过大造成动物死亡等效果,适用于研究化疗造成的肠黏膜损伤对机体的生理病理影响和评价长期营养支持的整体应用效果。
1.1.1 实验动物
SPF级SD雄性大鼠100只,体重(200±20)g,由南方医科大学实验动物中心【SCXK(粤)2013-0020】提供,整个实验过程均在标准的SPF级动物实验室【SYCK(粤)2011-0116】中进行,室温维持在22~25℃,湿度为(50±5)%,每笼5只,采用12 h∶12 h昼夜间断照明,每天定量添加饲料1次(饲料为普通实验鼠颗粒饲料,由南方医科大学实验动物中心提供),换水1次。适应性饲养一周后随机分为四组,开始实验。
1.1.2 试剂
注射用氨甲喋呤购于山西普德药业股份有限公司;D-乳酸标准品及 D-乳酸脱氢酶(D-LDH)、二胺氧化酶标准品(DAO)均购于Sigma公司,尸胺二氢氯化物购于东京化成工业株式会社,邻联茴香胺、辣根过氧化物酶、氧化型辅酶I和肝素钠均购于广州市齐云生物技术有限公司,MPO、MDA试剂盒购于南京建成生物研究所,其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器
高速/冷冻离心机(Thermo,美国),-80℃低温冰箱(Thermo,美国),低速离心机(Thermo,美国),酶标仪(Tecan,瑞士),紫外分光光度仪UV-1800(岛津,日本),差相荧光倒置显微镜(Leica,德国)。
1.2.1 大鼠肠黏膜炎模型的建立
采用MTX诱导肠黏膜损伤动物模型[6]。100只大鼠随机分为空白组(control group)、模型组Ⅰ(MTX group I)、模型组Ⅱ(MTX group II)和模型组Ⅲ (MTX group III),MTX group I 10只,其余每组各30只。第0天,MTX group I大鼠注射MTX(20 mg/kg);MTX group II和 MTX group III大鼠注射MTX(10 mg/kg)。在第6天,MTX group II大鼠再次注射10 mg/kg MTX;MTX group III大鼠再次注射5 mg/kg MTX。control group在第0天和第6天均注射等量的生理盐水。MTX group I在第4天全部处死;其余每组于造模后第 4、5、6、10、11、12 天各处死5只大鼠,进行指标分析。
1.2.2 标本收集
乙醚麻醉大鼠后,将其仰卧固定于手术台,沿腹部正中切口,首先心脏取血5 cm,置于装有肝素钠的离心管,离心分离血浆后-80℃保存待测。然后分离小肠组织,沿肠系膜纵轴剪开,用冰生理盐水冲洗净,肉眼观察大体形态并进行评分,同时取距回盲瓣5 cm处的3 cm回肠组织置于4%中性甲醛溶液固定,HE染色,光镜下观察组织学改变并评分,距10 cm处取5 cm小肠称重,-80℃保存待测。
1.2.3 观察指标及测定方法
(1)体重和进食量记录:实验期间,每日上午9时喂食,并记录大鼠体重,次日9时称剩余饲料重,计算大鼠24 h进食量,摄食量=(饲料总量-饲料余量)/只数。
(2)形态学观察、病理学分析及小肠组织损伤评分:将在甲醛中固定的小肠组织,常规石蜡包埋、切片、酒精梯度脱水、苏木素-伊红(HE)染色、在光镜下观察组织形态学改变。肠黏膜损伤程度按Chiu氏六级评分法[6]进行组织病理评分。其中采用盲法进行评分,评分人数为2人。
(3)D-乳酸测定:参照文献[7]方法测定。
(4)DAO测定:参照文献[8]方法测定。
(5)MPO测定:采用比色法测定,实验步骤参照试剂盒说明书要求严格操作。
(6)MDA测定:采用硫代巴比妥酸(TBA)法,实验步骤参照试剂盒说明书要求严格操作。
所有结果均使用SPSS 17.0统计软件分析。多组间比较采用单因素方差分析,两两比较
采用Duncan法;两组间比较采用两独立样本的t检验。结果以均数±标准差表示,P<0.05为差异有显著性意义。
如图1和图2所示,在实验期间,空白组大鼠的进食量和体重正常,呈缓慢增加。MTX group I大鼠的进食量明显下降,同时伴随着体重的显著降低。从第1天开始,MTX group II和MTX group III的进食量和体重逐渐下降,到第4天降到最低,从第5天开始两组大鼠进食迅速恢复,体重也逐渐回升;第2次注射MTX后大鼠的进食量和体重变化与第1次相似,但程度均有减弱,且MTX group III第2次注射MTX后进食量和体重下降程度均低于MTX group II。由此可见MTX导致的肠黏膜损伤是一个急性损伤过程,病程较短,且随着剂量增加,损伤程度加重。
显微镜下观察大鼠HE染色切片,发现空白组大鼠小肠肠壁层次清晰,结构完整,小肠绒毛排列紧密,如图3A。MTX group I大鼠在第4天小肠黏膜和黏膜下层间质水肿严重,毛细血管充血,小肠绒毛排列紊乱,高矮不一,大量倒伏、融合,绒毛尖端大量脱落,与固有层分离,隐窝形态和杯状细胞缺失,炎症细胞浸润(图3B)。MTX group II和 MTX group III大鼠(图3C)小肠黏膜与MTX group I形态相似,但损伤程度稍轻,第5天绒毛排列比较整齐,部分绒毛脱落,与固有层分离,如图3D;第6天大鼠小肠上皮结构比较完整,只有部分绒毛高矮不一,基本恢复正常如图3E。第10天MTX group II大鼠小肠黏膜形态出现小肠绒毛融合、肿大,固有层水肿等(图3 F),MTX group III大鼠小肠黏膜损伤程度小于MTX group II,仅部分绒毛脱落,间质水肿(图3 G)。第11、12天MTX group II大鼠开始慢慢好转,小肠上皮结构也较第10天完整(图3 H,J)。MTX group III第11天已经基本恢复正常(图3 I),第12天与空白组无明显差异(图3 K)。
图1 实验期间大鼠体重的变化Fig.1 Changes of body weight of the rats during the experiment
图2 实验期间大鼠进食量变化Fig.2 Changes of food intake of the rats during the experiment
如表1所示,三个模型组Chiu评分在第4天达到最大,与空白组差异有显著性(P<0.05)。到第6天,MTX group II、MTX group III和空白组的 Chiu 评分差异仍有显著性(P<0.05);第2次注射MTX后,MTX group II和MTX group III Chiu评分在第10天达到最大,与空白组差异均有显著性(P<0.05),且MTX group II显著高于MTX group III(P<0.05),第11天开始两模型组Chiu评分逐渐减小,但仍然显著高于空白组(p<0.05),且MTX group II与MTX group III之间差异也有显著性,MTX group II显著高于 MTX group III(P<0.05),到第12天时,三组差异无显著性。
注:图中MTX group II和 MTX group III(day 4,5,6)(图C、D、E)为该两组中随机抽取的大鼠小肠组织切片。图3 大鼠小肠HE染色切片(×200)Note.Fig.C,D and E:Intestine samples randomly selected from the MTX groups II and III.Fig.3 Histology of the rat small intestine.HE staining,×200
D-乳酸是哺乳动物肠道内固有细菌发酵代谢的终产物,血液中的D-乳酸基本上来源于肠道。当肠黏膜屏障受损时,肠黏膜绒毛顶端上皮脱落,通透性增加,同时局部细菌大量增殖,产生的D-乳酸即可通过受损肠黏膜经循环入血,并在血中蓄积,使血浆D-乳酸水平快速升高。D-乳酸在外周血中水平可反映肠黏膜损害程度和通透性变化[9]。如图4所示,在第4天,造模后的三组大鼠血浆中D-乳酸含量明显高于空白组(P<0.05),说明20和10 mg/kg MTX均可以导致大鼠小肠黏膜严重损伤。第5天开始,MTX group II和MTX group III的D-乳酸含量逐渐下降,但第6天其含量仍显著性高于空白组(P<0.05)。第2次注射MTX后,第10天MTX group II和MTX group III的D-乳酸含量达到最大,与空白组均有显著性差异(P<0.05),且MTX group II的D-乳酸含量显著性高于MTX group III(P<0.05)。到第12天,三组大鼠血浆中D-乳酸含量差异无显著性。
表1 大鼠小肠组织损伤程度评分(n=5)Tab.1 The scores for small intestine tissue injury in the rats(Chiu scores)
图4 大鼠血浆中D-乳酸含量的变化(n=5)Fig.4 Changes of D-lactate in the rat plasma(n=5)
DAO是哺乳动物小肠黏膜上层绒毛细胞胞质中具有高度活性的细胞内酶,在肠黏膜绒毛受损时,由肠黏膜细胞释放的 DAO大量地流入血液中,使其在血中浓度大幅上升,所以血液中DAO活性的高低反映了小肠黏膜上皮结构和功能的完整性[10-11]。如图5所示,在第4天,造模后的三组大鼠血浆中DAO活力明显高于空白组(P<0.05)。第5天开始,MTX group II和MTX group III活力逐渐下降,第6天MTX group II、MTX group III与空白组之间差异无显著性(P>0.05)。第2次注射MTX后,第10天MTX group II和MTX group III的DAO活力达到最大,与空白组比较差异均有显著性(P<0.05),且MTX group II的DAO活力显著性高于MTX group III(P<0.05)。第12天MTX group II血浆中DAO活力仍显著性高于空白组(P<0.05),而此时MTX group III和空白组之间差异无显著性(P>0.05)。
研究表明,中性粒细胞是引起组织损伤,乃至多器官功能衰竭的关键细胞。它在肠道损伤后引起局部和全身炎症反应中起到关键作用[12]。而MPO是中性粒细胞特有的酶,其活性大小与中性粒细胞的数量相关,反映了肠组织损伤过程中中性粒细胞的浸润程度[13]。如图6所示,在第4天,造模后的三组大鼠小肠组织中MPO活性明显高于空白组(P<0.05),第5天开始,MTX group II和 MTX group III MPO活力逐渐下降,但两组与空白组之间仍差异有显著性(P<0.05)。第6天,三组间已无明显差异(P>0.05)。第2次注射 MTX后,第10天 MTX group II和MTX group III的MPO活力达到最大,其中MTX group III与空白组差异有显著性(P<0.05)。到第11天MTX group II中MPO活力仍显著高于空白组(P<0.05)。第12天三组之间MPO活力恢复到同一水平(P>0.05)。
肠黏膜炎症过程中会产生大量的自由基(OFR),这些OFR可以攻击细胞各种成分,引发脂质过氧化反应,形成脂质自由基和过氧化物,从而造成细胞结构损伤,功能代谢障碍[14]。小肠组织内有着丰富的不饱和脂肪酸,最易发生脂质过氧化反应而造成损伤。稳定性较高的脂质过氧化反应产物MDA的含量可以反映细胞脂质过氧化的程度[15]。如图7所示,在第4天,造模后的三组大鼠小肠组织中MDA活性明显高于空白组(P<0.05),第5天开始,MTX group II和MTX group III的MDA含量逐渐下降,但两组与空白组之间仍有显著性差异(P<0.05)。第6天,三组间已无明显差异(P>0.05)。第2次注射MTX后,第10天MTX group II和MTX group III小肠组织中MDA含量达到最高,其中MTX group II与空白组有显著性差异(P<0.05)。到第11天MTX group II中MDA含量仍显著高于空白组(P<0.05)。第12天三组之间MDA含量恢复到同一水平(P>0.05)。
图5 大鼠血浆中DAO活力的变化(n=5)Fig.5 Changes of DAO in the rat plasma(n=5)
图6 大鼠小肠组织中MPO活力的变化(n=5)Fig.6 Changes of MPO in the rat small intestine tissues(n=5)
化疗代谢药物MTX引起肠黏膜损伤的作用机制主要是通过直接抑制小肠上皮细胞DNA的合成,从而导致肠隐窝细胞有丝分裂减弱和肠绒毛缩短,直至肠隐窝形态消失、绒毛皱缩脱落。本次实验发现大鼠注射MTX后小肠黏膜下层间质水肿,毛细血管充血,隐窝消失,绒毛萎缩、融合,混合细胞浸润,病理特征与Kolli等[16]研究结果相似。本次实验发现SD大鼠注射MTX(20 mg/kg)后,大鼠肠黏膜膜损伤严重,体重、进食量下降,腹泻严重,第4天发现有3只死亡。
图7 大鼠小肠组织中MDA含量的变化(n=5)Fig.7 Changes of MDA in the rat small intestinal tissues(n=5)
本研究还发现,20和10 mg/kg的MTX均可导致大鼠肠黏膜损伤,造模后大鼠血浆中D-乳酸含量和DAO活力均显著升高,且小肠组织中MPO活力和MDA含量升高,其在第4天达到最高,之后慢慢下降,在第6天就基本恢复正常。结合前人的研究结果和本实验结果可知MTX引发的大鼠肠黏膜炎是一个急性损伤过程,整个周期只能维持4~5d。而Howarth等[17]的研究也证实MTX导致的肠黏膜损伤在第6或7天就基本可以恢复正常。由此可知单剂量注射MTX虽然展现了化疗造成的肠黏膜炎的典型发病特征,但仅适用于评价短期内作用显著的化学药物或单一营养素的治疗效果,不适合中长期营养支持的整体效果评价。为了延长大鼠肠黏膜损伤时间,降低死亡率,本文试图模拟临床上肿瘤患者连续化疗的方法,在损伤恢复后再次注射MTX,造成持续性肠黏膜损伤。由于20 mg/kg剂量较高,一次性注射后已经造成30%的大鼠死亡,于是本文降低MTX剂量,并通过二次注射,造成大鼠肠黏膜二次损伤,由此整个损伤周期可以延长至12d。此外,研究发现在第2次注射MTX后大鼠症状与第一次相似,但损伤程度低于第1次,可能是连续二次注射,大鼠对MTX产生了耐药性。同时我们还发现第2次以5 mg/kg MTX注射,大鼠肠黏膜损伤较轻微,修复较快,在第二次注射后3~4 d基本与正常组无差异。因此本研究采用间歇式两次腹腔注射10 mg/kg MTX,造成肠黏膜持续损伤,由此成功建立肠黏膜持续损伤大鼠模型,其病理生理特征,与临床研究结果基本吻合。此模型更加适合于非药物型营养品的中长期治疗评价,为临床肠内营养品治疗肠黏膜损伤提供了评价平台。
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