节律基因per2在慢性粒细胞白血病中的表达及与bcr／abl的相关性

李 杰，杨 帆，封建凯，孙成铭，黄万里，张 霞＊

（1.青岛大学附属烟台毓璜顶医院检验科，山东烟台264000；2.栖霞市人民医院检验科；3.滨州医学院烟台附属医院检验科）

节律基因per2在慢性粒细胞白血病中的表达及与bcr／abl的相关性

李 杰1，杨 帆2，封建凯3，孙成铭1，黄万里1，张 霞1＊

（1.青岛大学附属烟台毓璜顶医院检验科，山东烟台264000；2.栖霞市人民医院检验科；3.滨州医学院烟台附属医院检验科）

目的 探讨节律基因per2在慢性粒细胞白血病中的表达及其与白血病融合基因bcr／abl的关系。方法收集30例慢性粒细胞白血病病人和9例健康对照的骨髓标本，RT－PCR检测per2和bcr／abl融合基因的表达，并分析两者之间表达的关系；不同浓度甲磺酸伊马替尼作用K562细胞不同时间后，通过RT－PCR检测bcr／abl和per2水平变化。结果 研究发现per2在慢性粒细胞白血病中表达降低，并且与bcr／abl的表达呈负相关。用甲磺酸伊马替尼处理K562发现，随着bcr／abl的表达降低，per2的表达升高。结论 per2在慢性粒细胞白血病中表达下降，并且和bcr／abl的表达呈负相关，提示per2在慢性粒细胞白血病的发生发展中发挥作用。

慢性粒细胞白血病；K562细胞；per2；bcr／abl

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1481）

慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）是一种造血干细胞恶性克隆增殖性疾病，其遗传学特征为t（9，22）（q34；q11），产生bcr／ab1融合基因，导致自身及细胞内多种底物蛋白酪氨酸残基磷酸化，激活多条信号传导途径，干扰细胞的基本活动，导致CML产生。因此，bcr／abl酪氨酸激酶目前被认为是治疗CML最理想的分子靶点。最新研究发现，生物钟系统不仅在昼夜生物节律方面起重要作用，而且参与机体其他功能的调节。该系统一旦失调可能引起一系列严重疾病发生，如淋巴瘤、白血病、乳腺癌和抑郁症等［1］。目前有研究表明per2在肿瘤中表达异常，但是在CML中的表达研究尚少，本研究检测per2在CML中的表达，以及其与bcr／ab1的关系，探讨生物钟基因per2在CML发生发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 病例资料 所有病例均来自烟台毓璜顶医院2009年到2012年的CML患者，经骨髓细胞形态学和染色体检查符合CML诊断标准。9例造血干细胞移植的健康供者作为正常对照。

1.2 试剂 逆转录试剂盒购自Promega公司，PCR试剂盒购自TIANGEN公司，DL2000购自TAKARA公司，Trizol购自Invitrogen公司。引物使用Primer Primier 5.0软件设计，由上海博亚公司合成。其余生化试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和药物干预 慢性粒细胞白血病细胞株K562为本实验室保存。在含10%小牛血清、100μg／ml青霉素和100μg／ml链霉素的RPMI1640培养基中以37℃，5%的CO2培养。取对数生长期的K562细胞，分别加入0.5，1，5μmol／L的甲磺酸伊马替尼，分别于24，48h之后收获细胞用来做RT－PCR检测。

1.3.2 RNA提取和逆转录 将收集的临床标本和收获的细胞中加入Trizol试剂1ml，参照Trizol试剂说明书的操作抽提RNA，用分光光度计测定浓度之后，取3μg RNA，用逆转录试剂盒得到cDNA，用来进行PCR扩增。

1.3.3 RT－PCR检测 以逆转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。Per2上游引物：5’ATTCTCCCATTCGGTTTC 3’，下游引物5’GAGGTCTGGCTCATAAGGT 3’；PCR扩增条件为95℃5min，95℃30s，52℃30s，72℃30s，72℃5 min，30个循环。bcr／ab1上游引物5’ATCCGTG－GAGCTGCAGATG3’，下游引物5’TTCCAACGAGCGGCTTCACT3’；β－actin上游引物5 GGCATCGTGATGGACTCCG3’，下游引物5’GCTGGAAGGTGGACAGCGA3’。扩增产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳，UVP扫描并分析结果。

1.3.4 统计学处理 采用Prism 4.03统计软件进行统计分析，用单因素方差分析（ANOVA），两两比较行t检验，采用相关性分析的方法分析bcr／abl和per2表达的关系，P＜0.05，表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 per2在慢性粒细胞白血病病人中表达明显降低 RT－PCR结果显示，与健康对照组相比，慢性粒细胞白血病病人表达per2明显降低。进一步分析9例健康对照和30例慢性粒细胞白血病人中的per2的表达，发现其差异具有统计学意义，P＜0.05（见图1）。

图1 RT－PCR检测per2和bcr－abl的表达

2.2 per2和bcr／abl在CML中的表达呈负相关对同时进行per2和bcr／abl检测的30例慢性粒细胞白血病人的标本进行相关性分析发现，per2和bcr／abl在慢粒病人中的表达呈负相关，r＝－0.3778，P＜0.05，具有统计学意义（见图2）。

在K562细胞中，用伊马替尼抑制bcr／abl的表达后，per2表达升高为了进一步确定per2和bcr／abl在慢性粒细胞白血病中的关系，我们用伊马替尼处理CML细胞系K562，结果发现处理24和48小时之后，bcr－abl的表达下降，而且per2的表达上升，如图3所示，1μM和5μM的伊马替尼处理24小时和48小时之后，per2的表达均有明显上调，差距有明显的统计学意义（P＜0.05）。

图2 per2和bcr－abl表达的相关性分析

图3 伊马替尼处理K562细胞后per2和bcr－abl的表达

3 讨论

节律系统普遍存在于生物界，当其系统异常或其基因突变时，机体正常机能将被打乱，甚至产生一些疾病，如心血管疾病、神经系统疾病以及肿瘤等。机体通过近日节律调控原癌基因、抑癌基因及凋亡基因的表达，对肿瘤发生具有直接或间接的作用，一旦生物钟基因表达异常引发节律改变即可促使肿瘤生长或患癌风险增加。目前，已经识别的哺乳动物的昼夜节律由一个自动调整的转录－翻译反馈回路组成，包括4种基因／蛋白质：BMal1，Clock，Cryptochrome和Period。其中per基因分为per1，per2，per3，研究显示Per基因在多种类型的白血病和淋巴瘤中表达下调，per2敲基因小鼠与野生小鼠相比发生淋巴瘤的几率增加10倍［2］。研究大量白血病和淋巴瘤病人以及正常对照骨髓和扁桃体中per2的表达显示，per2的表达在AML和DLBCL中表达明显下调［3］。

在本研究中，我们选用了全新的病例，结果与本课题组前期研究一致［4］，发现per2在CML病人骨髓中的表达降低，并且和bcr／abl的表达呈负相关，为了进一步验证该结论，在细胞系K562中通过甲磺酸伊马替尼处理细胞后，随着bcr／abl的表达降低，per2的表达升高。曾有学者研究per基因在CML病人的外周血比正常人的表达降低，和我们的研究结论是一致的，并且在CML病人中经常发现per2和per3启动子的CpG发生甲基化，在原始细胞危象的病人中per3甲基化的频率比在慢性期的病人中明显要高［5］，提示我们per2基因的表达降低可能由于其存在高频率的甲基化。另有体外细胞培养实验表明在人类和小鼠AML和前B淋巴细胞中强迫表达per2可以引起细胞生长抑制，细胞周期阻滞，凋亡和丧失克隆能力［6，7］。在人白血病细胞的体外研究中发现C／EBPα诱导per2表达至少在一定程度上参与了C／EBPα的肿瘤抑制功能［8，9］。

bcr－abl基因的产生是慢性粒细胞白血病的重要发生机制，基于此机制的靶向治疗药物酪氨酸激酶抑制剂的应用使CML治疗大为改观，但其耐药的产生使其远期疗效仍不容乐观，通过本研究为寻求新的治疗方法提供新的思路和理论基础。

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［4］孙成铭，冯文莉，寇新明，等.节律基因在慢性粒细胞白血病中表达水平及意义［J］.国际检验医学杂志，2011，32（03）：315.

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Expression of per2 gene in CML and its relationship with bcr／abl

LI Jie，YANG Fan，FENG Jian－kai，et al.（The Clinical Laboratorg Yantai Yu－huangding Affiliated Hospital of Qingdao Unlversity，Yantai 264000，China）

Objective This study was aimed to detect the expression of per2and bcr／abl in chronic myeloid leukemia（CML），and to analyze their relationship and potential significance.Methods 30cases of CML patients and 9cases of healthy people control were collected，their expression of per2and bcr／abl were detected by RT－PCR，their relationship was analyzed by correlation analysis.After K562cells were treated with different concentrations of Gleevie，the expression of per2and bcr／abl were detected by RT－PCR.Results We found that per2expression was downregulated in CML patients compared with control，and negative correlated with expression of bcr／abl.Moreover，expression of per2was enhanced in K562cells after treated with Gleevie，accompanied with decreased expression of bcr／abl.Conclusion per2 expression was decreased in CML patients compared with healthy control and negative correlated with bcr／abl expression，which suggested that per2may play an important role in the occurrence and development of CML.

chronic myeloid leukemia；K562cell；per2；bcr／abl

R733.7

A

2014－04－11）

1007－4287（2015）09－1481－03

烟台市科技发展计划（2012071）

＊通讯作者，E－mail：zx717＠163.com