Syndecan1慢病毒干涉质粒的构建及其对舌鳞癌CAL27细胞增殖的影响

王晓峰，孔晨飞，王 伟，张天夫＊

（吉林大学中日联谊医院1.口腔科；2.科学研究中心，吉林长春130033）

Syndecan1慢病毒干涉质粒的构建及其对舌鳞癌CAL27细胞增殖的影响

王晓峰1，孔晨飞2，王 伟1，张天夫1＊

（吉林大学中日联谊医院1.口腔科；2.科学研究中心，吉林长春130033）

目的 探讨RNA干扰Syndecan1基因对舌鳞癌CAL27细胞增殖的影响，阐明其作用机制。方法 构建靶向基因Syndecan1的siRNA载体重组质粒pDSL－hpUGIP－Syndecan1－1834、pDSL－hpUGIP－Syndecan1－1588、pDSL－hpUGIP－Syndecan1－544作为RNA干扰质粒组，同时设立阴性对照质粒组（pDSL－hpUGIP－control siRNA质粒）；采用荧光定量PCR检测Syndecan1mRNA的表达水平和表达抑制率；采用细胞计数法检测CAL27细胞的增殖率。结果 倒置荧光显微镜下观察，细胞感染率为90%。荧光定量PCR检测，RNA干扰组Syndecan1mRNA表达水平低于阴性对照组（P＜0.01），平均抑制率为68.6%。细胞增殖率检测，与阴性对照组比较，RNA干扰质粒组细胞增殖率明显升高（P＜0.01）。结论 干扰Syndecan1可抑制该基因的转录，并促进CAL27细胞的增殖。

Syndecan1基因；舌鳞癌；CAL27细胞；RNA干扰

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1447）

口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤。舌鳞状细胞癌是最常见的口腔鳞癌类型，由于其手术范围相对局限，肿瘤易发生侵袭、转移，导致舌鳞癌易复发，预后不良［1］。Syndecan1是硫酸类肝素蛋白聚糖家族（Heparin－sulphateproteoglyeans，HsPGs）的syndecans亚家族成员之一。Syndecan 1在多种上皮性肿瘤细胞表面均有表达，是肿瘤细胞与肿瘤微环境成分之间交流中的桥梁，在肿瘤细胞分化、增殖、侵袭转移及血管生成过程中发挥重要作用［2］。

我们构建了Syndecan1干涉慢病毒载体，转染舌鳞癌CAL27细胞，观察了Syndecan1siRNA质粒在CAL27细胞中的表达情况，为进一步探讨Syndecan1基因在舌鳞癌发生、发展中的作用及机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 RNAiso Plus提取试剂盒、PCR试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒购买于TaKaRa公司；感受态细菌购自天根公司；质粒小提试剂盒购买于Axygen公司；BamHI和XhoI限制性内切酶、T4连接酶购自NEB公司；反转录试剂盒购自Promega公司；DMEM培养基购自Invitrogen公司，反转录试剂盒、SYBR Green荧光定量染料购自大连TaKaRa宝生物工程有限公司；CAL27细胞、慢病毒表达载体四质粒系统包括载体质粒Entry载体pEN＿hH1c、包装质粒pMD，pAX及Destination载体pDSL＿hpUGIP为本实验室留存。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒干涉质粒的构建 用TE buffer稀释互补的寡核苷酸链，使其终浓度为50μmol／L；将干涉片段进行退火：分别吸取25μl（50μl体系）溶解好的成对干涉片段于PCR管中，混匀，95℃水浴5分钟，关闭水浴自然降温至室温，使互补的寡核苷酸链退火；将退火后的寡核苷酸链插入Entry载体，转化连接子，测序；将测序正确的Entry clone与Destination载体进行同源重组（重组体系：Entry clone：50－150ng；Destination vector（150ng／μl）：1 μl；LR ClonaseTMII enzyme mix：2μl；TE buffer，pH8.0：补足至10μl）。

将重组体系置于25℃水浴中1h；加入1μl Proteinase K，于37℃10min终止反应；将重组质粒转化感受态Stb13，挑取单克隆，进行测序。

1.2.2 慢病毒包装和感染 将人胚肾细胞293T接种于6cm细胞培养板中，温箱培养20h细胞贴壁后汇合度达到80%－90%可进行转染；用LipofectamineTM2000转染试剂将含有目的基因的慢病毒质粒与包装质粒psPAX2和pMD2.G按照4∶3∶1比例，8μg体系DNA转染293T细胞；8h后更换新鲜培养基；分别于48h、72h和96h收集病毒上清液并用0.45μm滤膜过滤；将过滤后病毒上清约15ml放入50ml超滤管，4℃，4 500rpm离心0.5－1h浓缩病毒，可收集病毒浓缩液约200μl；将50μl病毒浓缩液、8μg／ml聚凝胺与相应的细胞培养基混合，侵染目的细胞；6－8h后，更换新鲜的完全培养基，基因干涉情况可在病毒侵染后48h后对目的细胞进行检测。

1.2.3 反转录 使用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒提取哺乳动物细胞总RNA。反转录使用Promega公司的ImProm－IITMReverse Transcription System试剂盒（A3800）进行。

1.2.4 Real－time PCR实验 PCR实验采用两步法进行，反应条件为95℃60s，95℃15s和60℃60s，反应45个循环。反应中使用的DNA染料为带有荧光染料的PCR反应预混合物SYBR Green Realtime PCR Master Mix。所得结果的Cp值（threshold cycle）为达到超出荧光信号的检测阈值时所需的循环数。所得数据用2－ΔΔCp方法来计。Syndecan1上游引物序列：5’－AGGACGAAGGCAGCTACTCCT－3’，下游引物序列：5’－TTTGGTGGGCTTCTGGTAGG－3’，β－actin，上游引物：5’－TGACGTGGACATCCGCAAAG－3’，下游引物序列：5’－CTGGAAGGTGGACAGCGAGG－3’。

1.2.5 细胞增殖能力检测 1.0×105细胞接种于35mm皿中。每24h胰酶消化细胞并计数。分析实验结果并绘制生长曲线。

1.2.6 统计学分析 用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。Syndecan1基因mRNA表达水平、细胞增殖数以±s表示，组间比较采取单因素方差分析。

2 结果

2.1 重组质粒瞬时转染293FT细胞的转染效率 倒置荧光显微镜观察转染后的细胞，可观察到细胞带有绿色荧光（图1），表明重组的质粒成功转入了293FT包装细胞中。收集细胞培养液，感染CAL27细胞，倒置荧光显微镜观察并细胞计数，计算感染效率为90%，表明重组的质粒成功转入CAL27细胞中（图2）。

2.2 Syndecan1慢病毒干涉质粒的验证 如图3所示，RNA干扰质粒组Syndecan1mRNA表达抑制率分别为67.6%、58.4%和79.9%，平均抑制率为68.6%。

图1 转染慢病毒质粒的293FT细胞

图2 感染慢病毒的CAL27细胞

2.3 干涉Syndecan1促进CAL27细胞增殖 以各组CAL27细胞增殖数作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制生长曲线（图4）。培养72h后，Syndecan1RNA干扰质粒组CAL27细胞生长速度均明显高于对照组。

图4 细胞增殖率数

3 讨论

有文献报道，Syndecan 1表达下降或缺失与结直肠癌的组织低分化和临床分期高［3］、皮肤基底细胞癌强侵袭性［4］、肝内胆管细胞癌的不良预后［5］等多项因素有关。上述研究表明，Syndecan1在多种恶性肿瘤中均有异常表达，能够调节正常细胞及多种肿瘤细胞凋亡、增殖或细胞周期功能。但在舌鳞癌发生、发展中的作用及具体分子机制的研究尚处于空白阶段。

本实验利用siRNA技术构建了Syndecan1siRNA慢病毒质粒，成功干扰CAL27细胞中Syndecan1mRNA的表达水平，使得细胞增殖率明显增加，初步发现了Syndecan1基因对舌鳞癌细胞的影响。

本项研究中构建了pDSL－hpUGIP－Syndecan1重组慢病毒表达载体，用慢病毒重组质粒及空载体阴性对照分别感染舌鳞癌CAL27细胞，在荧光显微镜下观察，感染细胞均呈明显绿色荧光。运用RT－PCR实验对干涉质粒的干涉效果进行验证。通过MTT实验检测了干扰Syndecan1后细胞的增殖情况，发现敲除内源Syndecan1后，舌鳞癌细胞的增殖能力明显增强。这一结果提示我们Syndecan1可能在舌鳞癌的发生发展中发挥着抑癌作用。

［1］Greenlee RT.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2001，51（1）：15.

［2］BartlettAH，HayashidaK，ParkPW.Molecular and cellular mechanisms of syndecans in tissue injury and inflammation［J］.Mol Cells，2007，24（2）：153.

［3］Lundin M，Nordling S，Lundin J，et al.Epithelial syndecan 1expression is associated with stage and grade in colorectal cancer［J］.Oncology，2005，68（4－6）：306.

［4］Bayer－Gamer IB，Dilday B，Sanderson RD，et al.Syndcean 1expression is decreased with increasing aggressiveness of basal cell careinoma［J］.Am J Dermato Pathol，2000，22：119.

［5］Harada K，Masuda S，Hirano M，et al.Reduced expression of syndcean－1correlates with histologic dedifferentiation，lymph node metastasis，and poor prognosis in inirahepatic cholangioeareinoma［J］.Hum Pathol，2003，34（9）：857.

Effect of RNA interference of Syndecan1 gene on proliferation of tongue squamous carcinoma CAL27 cells

WANG Xiaofeng，KONG Chen－fei，WANG Wei，et al.（Department of Stomatology，China－Janpan Union Hospital，Jilin University，Chanchun130033，China）

Objective To investigate the effect of RNA interference of Syndecan1gene on the cell proliferation of tongue squamous carcinoma CAL27cells，and to elucidate the mechanism.Methods Three siRNA plasmids targeting human Syndecan1gene，including pDSL－hpUGIP－Syndecan1－1834、pDSL－hpUGIP－Syndecan1－1588and pDSL－hpUGIP－Syndecan1－544，were constructed and regarded as RNA interference plasmid grous.pDSL－hpUGIP－control siRNA plasmid was regarded as negative control.RT－PCR was used to detect the expression of Syndecan1mRNA and the inhibitory rates of CAL27cells was evaluated.Results The infection rate of cells was 90%under inverted fluorescence microscope；the RT－PCR results showed that the levels of Syndecan1mRNA in RNA interference plasmid grous were lower than those in negative control group（P＜0.01），and the average inhibitory rate was 68.6%.Compared with negative control，the proliferation rates of CAL27cells in RNA interference plasmid grous were increased（P＜0.01）.Conclusion Interference of Syndecan1gene might inhibit the transcription of the gene and further increase the proloferation of CAL27cells.

Syndecan1gene；tongue squamous carcinoma；CAL27cells；RNA interference

R739.86

A

2014－11－26）

1007－4287（2015）09－1447－03

吉林省科技厅自然科学基金课题（2012150780）

＊通讯作者