培养不同时间CIK细胞免疫表型变化与其抗肿瘤活性关系的研究

赵 鑫，常 颖，刘玉侠，卢卫平，王 哲，王 宝，于 鸿，王启文＊

（1.吉林省肿瘤医院，吉林长春130012；2.吉林省肿瘤防治研究所，吉林长春130012）

培养不同时间CIK细胞免疫表型变化与其抗肿瘤活性关系的研究

赵 鑫1，常 颖1，刘玉侠2，卢卫平1，王 哲1，王 宝1，于 鸿2，王启文1＊

（1.吉林省肿瘤医院，吉林长春130012；2.吉林省肿瘤防治研究所，吉林长春130012）

目的 探讨培养不同时间的CIK（cytokine induced killer cells）细胞免疫表型变化及其对肿瘤细胞杀伤活性的关系，为CIK临床治疗肿瘤提供实验数据。方法 分离人外周血单核细胞，加IFNγ、IL1α、CD3Ab、IL－2等细胞因子诱导CIK细胞并进行鉴定，将经过鉴定的CIK与肺癌细胞A549共同培养，检测不同时间培养的CIK表型变化与对A549的体外杀伤效果的关系。结果 培养不同时间（10天、15天、20天）的CIK细胞CD3＋CD56＋CD16＋表达率分别为42.1%，63.3%，77.1%，对A549的杀伤效率分别为41.75%，54.43%，79.31%。结论 随着培养时间延长，CIK免疫表型表达率逐渐上升，对A549的杀伤效率也随之逐渐增强，本实验杀伤活性最高为20天，提示在临床应用时可以根据不同时间CIK免疫表型表达情况选择应用时间，达到使用的最佳效果。

CIK细胞；细胞表型；肺癌细胞A549；杀伤活性

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1455）

恶性肿瘤的治疗除了传统的手术、化疗、放疗等方法，生物治疗也是肿瘤治疗的一种选择。由于生物治疗对病人没有明显的副作用，所以对不能手术的病人以及放疗、化疗后的病人的后续治疗起到非常重要的作用。CIK（cytokine induced killer cells）作为生物治疗方法的一种，由于它对肿瘤强大的杀伤力以及无MHC限制等特点，使它的应用备受关注。本实验选择肺癌细胞A549作为CIK杀伤作用的靶细胞，比较培养不同时间的CIK表型变化与对肺癌细胞A549杀伤活性的关系，为CIK的临床应用提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 细胞培养液IMDM，购于Gibco公司；细胞因子IFN－γ，上海凯茂生物医药有限公司；IL－1α，Peprotech公司；anti－hunman CD3，R＆D公司；IL－2，北京四环生物制药有限公司；FCS，北京元亨；CCK8，购自上海同仁化学研究所；anti－hunman CD3－FITC，anti－hunman CD16、CD56－PE，购自BD公司。

1.2 人肺癌细胞A549 吉林省肿瘤防治研究所保存。

1.3 实验设备 低温高速离心机，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培养箱，Thermo Scientific公司；全自动酶标仪，芬兰雷勃公司；流式细胞仪，BD公司。

1.4 CIK细胞的培养 用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞，加IFN－γ，IL－1α，anti－hunman CD3，IL－2等细胞因子，每3天换液，补加细胞因子。

1.5 CIK的鉴定 在培养的第10天，15天，20天分别用anti－hunman CD3－FITC，anti－hunman CD16、CD56－PE标记CIK细胞，用流式细胞仪测定表达率。

图1 CIK表型鉴定结果

1.6 CIK杀伤活性测定

1.6.1 培养肺癌细胞A549 将A549细胞从液氮中取出，复苏，培养至对数生长期，调细胞数为5× 104／ml，加到96孔细胞培养板，100μl／孔，6复孔。

1.6.2 将培养的CIK细胞分别在第10、15、20天计数，调细胞数为1.25×106／ml，加到已接种A549的96孔细胞培养板（效靶比为25∶1），100μl／孔，同时设效应细胞（CIK）对照组和靶细胞（A549）对照组，每组设6复孔，培养24h。

1.6.3 培养结束前4小时加入CCK8，20μl／孔，培养结束后，用酶标仪在492nm处测OD值。

1.6.4 杀伤活性测定方法 杀伤活性（%）＝［（1－实验组OD值－效应细胞OD值）／靶细胞OD值］×100%。

1.7 结果统计 采用成对双样本均值T检验进行统计分析。

2 结果

2.1 CIK表型鉴定结果 培养10天CIK细胞CD3＋CD56＋CD16＋表达率为42.1%，见图1a。培养15天CIK细胞CD3＋CD56＋CD16＋表达率为63.3%，见图1b。培养20天CIK细胞CD3＋CD56＋CD16＋表达率为77.1%，见图1c。

2.2 培养不同时间CIK对A549的杀伤活性，见表1。

表1 培养不同时间CIK对A549的杀伤活性（±s，n＝6）

表1 培养不同时间CIK对A549的杀伤活性（±s，n＝6）

※P＜0.01，与10天比较，△△P＜0.01，与10天，15天比较。

分组时间 靶细胞组（A549）效应细胞组（CIK）实验组（CIK＋A549）杀伤活性（%）10天2.284±0.074 1.124±0.059 2.454±0.075 41.75±3.31 15天2.546±0.141 1.499±0.048 2.659±0.048 54.43±1.89※20天2.233±0.068 1.359±0.265 1.821±0.156 79.31±7.01△△

3 讨论

CIK细胞作为肿瘤生物治疗的一种，由于其强大的抗瘤活性和非限制性的杀瘤特点，近年来在肿瘤的综合治疗中发挥着重要作用。本实验通过培养不同时间的CIK细胞表型变化及对肺腺癌的杀伤活性的研究，为CIK治疗肺癌提供实验数据。

肺癌是近年来发病率比较高的恶性肿瘤，针对肺癌的治疗方法主要是手术、化疗、放疗等，在这些治疗中或治疗后，病人往往出现免疫功能低下等问题，影响治疗的进行及治疗效果，需要其它方法配合治疗。生物治疗因为可以直接攻击肿瘤细胞，调动机体的免疫功能，无放疗、化疗的副作用，在肿瘤的综合治疗中起着非常重要的作用。

本实验选用培养不同时间的CIK细胞对肺癌细胞A549进行体外杀伤活性实验，首先对CIK在培养不同时间（10天，15天，20天）的细胞表型进行鉴定，结果证明随着培养时间的变化，细胞表面标志（CD3，CD16，CD56）的表达也发生变化，表达率逐步升高，分别达到42.1%，63.3%，77.1%，而对培养不同时间的CIK进行杀伤活性实验的结果也显示杀伤率随着时间逐渐增高，分别为10天，41.75%；15天，54.43%；20天，79.31%，与表面标志的表达成正相关，各时间段杀伤活性比较有显著差异（P＜0.01）。

本实验检测结果显示，CIK细胞可以同时表达CD3＋CD56＋CD16＋膜蛋白分子，所以又被称为NK细胞样淋巴细胞，因此具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性以及NK细胞非MHC限制性杀瘤的特点［1］，可以对肿瘤细胞进行直接杀伤，也可以通过分泌多种抗肿瘤细胞因子，如IFN－γ、TNF－α、IL－2等调节机体免疫系统间接杀伤肿瘤细胞［2］，诱导肿瘤细胞凋亡，保证抗肿瘤活性的长期持久。已有研究证明化疗联合CIK治疗对多种肿瘤具有较好的疗效［3］，而且没有明显的毒副反应［4］，可以促进患者免疫功能重建［5，6］。本实验以肺腺癌细胞A549作为研究对象，通过体外实验证明CIK对A549具有较强的杀伤效力，而且CIK的表达率与杀伤活性成正相关，为CIK治疗肿瘤提供了实验数据和支持。

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［2］Shablak A，Hawkins RE，Rothwell DG，et al.T cell－based immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma：Modest success and future perspective［J］.Clin Cancer Res，2009，15（21）：6503.

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［4］Jiang JT，Shen YP，Wu J，et al.Increasing the frequency of CIK cells adoptive immunotherapy may decrease risk of death in gastric cancer patients［J］.World J Gastroenterol，201016（48）：6155.

［5］Jiang J，Xu N，Wu C，et al.Treatment of advanced gastric cancer by chemotherapy combined with autologous cytokine－induced killer cells［J］.Anticancer Res，2006，26（3B）：2237.

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Study of relationship of CIK cells phenotype change and its anti－tumor activity at different time

ZHAO Xin，CHANG Ying，LIU Yu－xia，et al.（Jilin Province Tumor Hospital，Changchun130012，China）

Objective To Explore the relationship of CIK cells（cytokine induced killer cells）phenotype change and its anti－tumor activity at different time，provide experimental data for the clinical application of CIK.Methods Isolated from human peripheral blood mononuclear cells，Plus IFNγ，IL1α，CD3Ab，IL－2and other cytokines induced CIK cells and identified，then，identified CIK with A549cells were co－cultured，detect different time cultured CIK immune phenotypic changes and on A549cells killing effects in vitro.Results Culture at different times（10days，15days，20days）of CIK cells CD3＋CD56＋CD16＋expression rates were 42.1%，63.3%，77.1%，Cytotoxicity against A549were 41.75%，54.43%，79.31%.Conclusion As the incubation time，CIK phenotype expression rate gradually increased，Killing efficiency of A549with the gradual enhancement，In this study，the cytotoxic activity of up to 20days，prompt that we can depending on the CIK immune phenotype expression choose to apply the time，achieve the best results.

CIK cells；Cell phenotype；Lung cancer cells A549；killing activity

R392

A

2014－03－19）

1007－4287（2015）09－1455－03

＊通讯作者