反相高效液相色谱法测定去甲斑蝥素齐墩果酸复合脂质体包封率*

方志娥 ，陈 薇 ，唐直婕 ，冷 静

（1.重庆市中医院，重庆 400021； 2.重庆医科大学药学院，重庆 400016）

去甲斑蝥素（NCTD）由马来酐和呋喃反应后制得的人工全合成化合物，具有较强的抑制肝癌等多种癌细胞生存等作用，对泌尿系统、胃肠道、骨髓毒副作用低［1-2］。齐墩果酸（OA）为五环三萜类天然化合物，对肝癌细胞具有明显的抑制作用，且呈时间和浓度依赖性［3］，还具有抗炎抗病毒等作用［4］。脂质体是由磷脂分散在水中形成具有双分子层的超微球状粒子，进入体内后主要被网状内皮系统摄取，具有肝靶向性，可用于治疗肝肿瘤及防止淋巴系统肿瘤等的扩散和转移。本研究中采用薄膜分散法，制备去甲斑蝥素齐墩果酸复合脂质体，并采用冷冻超速离心-梯度洗脱反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定复合脂质体中去甲斑蝥素和齐墩果酸的包封率。现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪（配G1312C型二元泵，G1314F型紫外检测器，G1329B型自动进样器及Agilent Chemstation化学工作站，美国Agilent公司）；BS210S型电子分析天平（德国Sartorious公司）；KQ-3200E型超声仪（江苏省金坛市医疗仪器厂）；Thermo Micro 21／21R型冷冻超速离心机（美国Thermo公司）；LD-50G-D型超纯水处理器（重庆利迪实验仪器设备有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。去甲斑蝥素对照品（批号为100414-200501）、齐墩果酸对照品（批号为110709-201206）均由中国药品生物制品检定所提供；去甲斑蝥素（纯度98%）、齐墩果酸（纯度98%）均由南京泽朗医药科技有限公司提供；去甲斑蝥素和齐墩果酸复合脂质体（重庆医科大学医学院实验室自制，批号分别为 20130319，20130325，20130329）；大豆卵磷脂（纯度99%）、胆固醇（纯度99%）均由成都市科龙化工试剂厂提供；甲醇（美国Teddy公司）为色谱纯，Triton X-100（上海晶纯实业有限公司）和其他试剂均为分析纯，试验用水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 复合脂质体及溶液制备

空白脂质体：称取卵磷脂240 mg，胆固醇80 mg，溶于二氯甲烷30 mL中，将此溶液置250 mL圆底烧瓶中，35℃水浴下旋转蒸发形成类脂质薄膜后，加入pH＝7.0的磷酸盐缓冲液（PBS）15 mL，水合 2 h，超声 20 min；过 0.45 μm 微孔滤膜，得空白脂质体混悬液。取适量空白脂质体混悬液，加入适量10%Triton X-100甲醇溶液破乳，过膜，测定。

含药脂质体：称取卵磷脂240 mg，胆固醇80 mg，去甲斑蝥素20 mg，齐墩果酸10 mg，同空白脂质体制备方法制得含药脂质体混悬液。取适量含药脂质体混悬液，加入适量10%Triton X-100甲醇溶液破乳，过膜，测定。

标准贮备液：准确称取去甲斑蝥素对照品50.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.0 g／L的标准贮备液，保存于4℃。准确称取齐墩果酸对照品25.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，配制成质量浓度为0.5 g／L的标准贮备液，保存于4℃。

标准混合溶液：精密量取去甲斑蝥素和齐墩果酸标准贮备液适量，混合，用甲醇稀释，依次配制成去甲斑蝥素质量浓度为20，50，100，200，300 μg ／mL 和齐墩果酸质量浓度为 10，25，50，100，150 μg／mL的标准混合溶液，保存于4℃。

2.2 色谱条件

色谱柱：Thermo Sycronis C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），保护柱为 Agilent Zorbax C18填料（12.5 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：A为纯化水（磷酸调节pH至3.2），B为甲醇，梯度洗脱条件见表 1；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：50 μL。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.3 方法学考察

专属性试验：在拟订色谱条件下进样测定。结果标准混合溶液、空白脂质体和含药脂质体的色谱图见图1。可见，去甲斑蝥素约在3.7 min出峰，齐墩果酸约在8.5 min出峰，表明杂质峰不干扰主峰，该方法专属性强。

图1 去甲斑蝥素和齐墩果酸脂质体高效液相色图谱

线性关系考察：按2.1项下方法制配去甲斑蝥素质量浓度为20，50，100，200，300 μg ／mL 和齐墩果酸质量浓度为 10，25，50，100，150 μg／mL的标准混合溶液，在拟订色谱条件下测定，以质量浓度（C，μg／mL）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标进行线性回归。回归方程去甲斑蝥素为 A ＝2.17C+5.19（r＝0.999 8，n＝5），齐墩果酸为 A ＝22.10 C-73.49（r＝0.999 7，n＝5）。结果表明，去甲斑蝥素质量浓度在20～300 μg／mL范围内［检出限为4.5 μg／mL（S ／N ＝3）］、齐墩果酸质量浓度在 10 ～150 μg／mL 范围内［检出限为 4.0 μg／mL（S／N ＝3）］与峰面积线性关系良好。

精密度试验：按2.1项下方法制配去甲斑蝥素质量浓度为20，100，300 μg ／mL 和齐墩果酸质量浓度为 10，50，150 μg ／mL的标准混合溶液，按拟订色谱条件进样测定，各连续进样5次。结果，去甲斑蝥素低、中、高3个质量浓度的 RSD≤3.25%（n＝5），齐墩果酸低、中、高3个质量浓度的 RSD≤3.04%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：按2.1项下方法制配去甲斑蝥素质量浓度为20，100，300 μg ／mL 和齐墩果酸质量浓度为 10，50，150 μg ／mL的标准混合溶液，于4℃保存，按拟订色谱条件分别于1，3，5，7，12，24 h时进样测定。结果，去甲斑蝥素低、中、高3个质量浓度的RSD≤2.16% （n＝6），齐墩果酸低、中、高 3 个质量浓度的RSD≤2.84%（n＝6），表明标准混合溶液在24 h内稳定。

重复性试验：按2.1项下方法配制去甲斑蝥素质量浓度为20，100，300 μg ／mL 和齐墩果酸质量浓度为 10，50，150 μg ／mL的标准混合溶液各5份，按拟订色谱条件进样测定。结果去甲斑蝥素低、中、高3个质量浓度的 RSD≤5.89%（n＝5），齐墩果酸低、中、高3个质量浓度的 RSD≤4.22%（n＝5），表明方法重复性良好。

回收率试验：取2.1项下制备的空白脂质体，加入去甲斑蝥素和齐墩果酸标准混合溶液，制备含去甲斑蝥素质量浓度分别为20，100，300 μg／mL 和齐墩果酸质量浓度分别为 10，50，150 μg／mL的脂质体。取50 μL脂质体加入1 mL 10%Triton X-100甲醇溶液破乳。按拟订色谱条件进样测定，每个质量浓度连续测定5次，计算回收率。结果见表2。

表2 去甲斑蝥素和齐墩果酸的回收试验结果（n＝5）

2.4 脂质体包封率测定

精密量取2.1项下3批含药脂质体（批号分别为20130319，20130325，20130329）溶液 1.0 mL，置冷冻超速离心机中，14 800 r／min 4℃离心95 min。取上清液按拟订色谱条件进样测定，计算游离药物浓度（C游）；同时将离心前的脂质体混悬液用10%Triton X-100甲醇溶液破乳并稀释至适当倍数测定，计算出药物总浓度（C总），按以下公式计算药物包封率：包封率（%）＝（C总-C游）／C总×100%。结果脂质体中去甲斑蝥素的平均包封率为（48.01±2.34）% （n＝5），齐墩果酸的平均包封率为（87.31 ± 0.56）% （n ＝ 5）。

3 讨论

脂质体包封率测定方法的确定：测定脂质体包封率的常用方法有透析法［5］、葡聚糖凝胶柱色谱法［6］、鱼精蛋白凝聚法［7］、离心法［8］等。透析法简单，不需昂贵的仪器，但耗时较长。葡聚糖凝胶柱色谱法分离脂质体和游离药物时洗脱液对脂质体进行了大量稀释，可能导致脂质体渗漏。鱼精蛋白凝聚法的测定结果受脂质体Zeta电位影响。超速离心法对离心机要求较高，但操作简单，耗时短，可有效分离脂质体和游离药物。因此，选用超速离心法测定脂质体包封率。

高效液相色谱（HPLC）法的确定：去甲斑蝥素和齐墩果酸的结构相差较大，在色谱柱中的保留行为有差异。以标准混合溶液试验了等度和梯度2种洗脱方式。考察了流动相组成水（磷酸调节 pH 至 3.2）∶甲醇（V ／V）为 65 ∶35，45 ∶55，25 ∶75，5 ∶95 时等度洗脱去甲斑蝥素和齐墩果酸的分离情况。结果表明，去甲斑蝥素和齐墩果酸色谱峰的出峰时间随流动相中有机相含量的增加而逐渐减小，由于齐墩果酸的脂溶性较强，只有在高比例的有机相条件下出峰较快，同时去甲斑蝥素色谱峰和溶剂峰不能完全分离，故考虑使用梯度洗脱使2种物质得到最佳分离并缩短分析时间。经过考察，梯度洗脱条件：0～3 min，水（磷酸调节pH至3.2）∶甲醇（V ／V）为 65 ∶35，流速为 1.0 mL ／min；3 ～3.5 min，水（磷酸调节 pH 至 3.2）-甲醇（V ／V）为65∶35→5∶95，流速为 1.0 mL ／min；3.5 ～4.5 min，水（磷酸调节 pH 至 3.2）∶甲醇（V ／V）为 5 ∶95，流速为 1.0→1.7 mL／min；4.5 ～10 min，水（磷酸调节 pH 值至 3.2）∶甲醇（V ／V）为 5 ∶95，流速为 1.7 mL ／min。此时，去甲斑蝥素和齐墩果酸得到最佳分离且分析时间大大缩短。

参考文献：

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