去甲斑蝥素对人肝癌SMMC－7721细胞凋亡相关因子半胱天冬酶3、bax和细胞色素C表达的影响

张 梅 黑龙江中医药大学生物化学与分子生物学教研室 （哈尔滨150040）

去甲斑蝥素的化学结构和天然药物斑蝥素类似，仅在后者的1，2位去甲基，已能人工化学合成。经过化学结构的修改，可大大降低斑蝥素对泌尿系统的刺激性，国内外文献通过体内外研究证实去甲斑蝥素对多种人恶性肿瘤细胞具有一定的抑制作用，而其抗肿瘤活性的机制是诱导肿瘤细胞凋亡［1－3］。去甲斑蝥素目前已用于临床治疗胃癌、肝癌和食管癌等，除了能有效抑制肿瘤细胞生长之外，还有升白细胞的临床作用［4－5］。本研究主要讨论去甲斑蝥素对人肝癌SMMC－7721细胞增殖的影响，并尝试通过分子生物学手段探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。

1 试剂和仪器 1.1 药物和试剂 去甲斑蝥素（山东信谊制药有限公司，批号20130527）；RPMI－1640培养基（美国Gibico公司）；小牛血清（武汉华美生物工程公司）；胰蛋白酶（美国 Gibco公司）；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐（MTT）（上海普飞生物技术有限公司）；细胞培养瓶及培养板（美国Costar公司）。Annexin V－FITC／PI凋亡检测试剂盒（美国Beckman Coulter公司）；线粒体－胞浆分离试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；活化半胱天冬酶3（caspase－3）、bax、细胞色素C抗体（美国Bioworld公司）。

1.2 仪 器 LDZ5－2型离心机（北京医用离心机厂）；二氧化碳恒温培养箱（美国Forma公司）；倒置相差显微镜、荧光显微镜（日本Olympus公司）；Epics－XL－Ⅱ型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；ELx808型吸收光酶标仪（美国伯腾仪器公司）。

1.3 细 胞 人肝癌SMMC－7721细胞株（中国科学院上海生科院细胞资源中心）。将SMMC－7721细胞株置含有10%小牛血清和80U／L庆大霉素的RPMI－1640细胞培养基（pH＝7.4）内，在37℃恒温、5%CO2环境下孵育。

2 方 法 2.1 肿瘤细胞生长抑制率 将对数生长期的SMMC－7721细胞株用培养基稀释至细胞浓度为105个／mL，将100μL细胞液分别接种在96孔细胞培养板的每个孔内，在37℃恒温和5%CO2环境下孵育24h后再加入等体积去甲斑蝥素的培养基溶液，去甲斑蝥素的终浓度为1、5、25、125mg／L，以上各个浓度梯度作为药物组，另用不加药物的细胞孔作为对照组，用培养基作为空白组，药物组、对照组、空白组均设置平行孔以减少实验误差。在24h、48h和72h后避光操作加入5mg／mL浓度的MTT溶液20μL，继续37℃恒温避光培养细胞3h后结束培养。在每个孔中加入0.15mL二甲亚砜，处理5min后将培养板置酶标仪中，在波长570nm处测定吸光值，通过空白组的平均吸光值校正药物组和对照组的吸光值，则：肿瘤细胞生长抑制率（%）＝（1－药物组吸光值／对照组吸光值）×100%。

2.2 肿瘤细胞凋亡率 收集培养24h后的SMMC－7721细胞，用无水乙醇固定，置－70℃冰箱中保存。用磷酸盐缓冲液冲洗固定后的细胞，1200r／min离心5min，分别加入荧光染色剂Annexin V－FITC使成终浓度20μg／mL，避光染色20min，再加入5μL PI染色剂使成终浓度50μg／mL，在37℃下避光染色40min，采用流式细胞仪检测细胞周期的变化。

2.3 caspase－3、bax和细胞色素C的表达 对照组和药物组细胞培养24h后，采用磷酸盐缓冲液冲洗分散和冲洗3遍，在3000r／min下离心10min，将沉淀悬浮在200μL预冷的细胞裂解液中，冰浴1h后在12000r／min下离心20min，弃去沉淀得到细胞的总蛋白，而检测细胞色素C表达水平采用胞浆蛋白。将缓冲液加入上述蛋白，在沸水中水浴10min，采用聚丙烯酰胺（SDS－PAGE）凝胶电泳法分离不同类型的蛋白，再转移至聚偏二氟乙烯膜后，在37℃恒温下处理50min，采用免疫印迹法按步骤获得荧光二抗后测定caspase－3、bax和细胞色素C的表达水平。

2.4 统计学方法 应用SPSS 20统计学软件处理数据，计量资料用均数±标准差（±s）表示，计量资料的比较采用t检验，检验水准α＝0.05。

3 结 果 3.1 肿瘤细胞生长抑制率 不同浓度的去甲斑蝥素对SMMC－7721细胞有不同的抑制率，表现出对肿瘤细胞的细胞毒作用（n＝6）。相同浓度的去甲斑蝥素作用时间越长，细胞生长抑制率越高；作用相同时间的去甲斑蝥素浓度越高，细胞生长抑制率越高。去甲斑蝥素对SMMC－7721细胞生长抑制率见表1。

表1 去甲斑蝥素对SMMC－7721细胞生长的抑制率（±s）

表1 去甲斑蝥素对SMMC－7721细胞生长的抑制率（±s）

去甲斑蝥素浓度（mg／L）细胞生长抑制率（%）作用24h后 作用48h后 作用72h后1 6.24±1.49 9.48±2.65 23.46±6.97 5 20.45±3.86 24.07±4.16 38.65±6.43 25 36.57±8.40 46.71±8.52 59.56±7.25 125 59.30±12.12 58.45±9.85 81.24±13.12

3.2 肿瘤细胞凋亡率 经过不同浓度去甲斑蝥素处理的SMMC－7721细胞恒温培养24h后，通过流式细胞仪测定细胞的凋亡情况（n＝6），结果见表2。药物组细胞均有不同程度的早期凋亡和晚期凋亡。随着去甲斑蝥素浓度的提高，总凋亡率相应升高；药物组的总凋亡率均高于对照组，差异均有统计学意义（t＝10.758、16.931、33.955、22.358，P 均＜0.05）。

表2 去甲斑蝥素对SMMC－7721细胞的凋亡率（±s）

表2 去甲斑蝥素对SMMC－7721细胞的凋亡率（±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05

去甲斑蝥素浓度（mg／L）早期凋亡率（%） 晚期凋亡率（%）总凋亡率（%）对照组0.12±0.08 0.31±0.12 0.43±0.11 1 4.54±2.49 9.46±3.28 14.01±3.09△5 11.74±4.58 23.95±3.09 35.69±5.10△25 20.07±6.15 48.38±9.11 68.46±8.24△125 27.67±8.19 61.03±10.80 88.70±9.67△

表3 去甲斑蝥素对caspase－3、bax和细胞色素C表达的影响（±s）

表3 去甲斑蝥素对caspase－3、bax和细胞色素C表达的影响（±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05

去甲斑蝥素浓度（mg／L）积分吸光度caspase－3 bax 细胞色素C对照组0.21±0.08 0.16±0.05 0.18±0.06 1 0.19±0.07 0.13±0.04 0.25±0.05 5 0.23±0.11 0.15±0.06 0.18±0.07 25 0.46±0.12△ 0.22±0.03△ 0.50±0.12△125 0.77±0.19△ 0.46±0.09△ 0.48±0.14△

3.3 caspase－3、bax和细胞色素C的表达 经过不同浓度去甲斑蝥素处理的SMMC－7721细胞恒温培养24h后，通过免疫印迹法测定caspase－3、bax和细胞色素C的积分吸光度（n＝6），结果见表3。可见，随着去甲斑蝥素的浓度提高，caspase－3、bax和细胞色素C的表达量均升高；浓度为25、125mg／L的去甲斑蝥素处理细胞后，caspase－3、bax和细胞色素C的蛋白表达量均高于对照组，差异均有统计学意义（t＝4.246、2.521、5.842、6.654、7.137、4.825，P 均＜0.05）。

4 讨 论 斑蝥素是昆虫斑蝥的主要抗肿瘤有效成分，可治疗食管癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤疾病，然而斑蝥素口服后会产生较严重的胃肠道不良反应，限制其临床进一步推广应用［6］。去甲斑蝥素去除斑蝥素分子中的1，2位两个甲基，并实现人工合成，价格较低廉，可大大降低消化道不良反应的发生率，且具有与斑蝥素相同的抗肿瘤活性，还有升高白细胞的作用，骨髓抑制现象较少见［7－8］。近年来有关去甲斑蝥素的药理作用研究逐步深入开展，并可制备成多种药物新剂型［9－11］，大大拓展了其临床应用前景，但在分子生物学水平对去甲斑蝥素的研究尚需进一步探讨和明确。

采用MTT染色可检测药物对肿瘤细胞生长的抑制情况。本研究发现不同浓度的去甲斑蝥素均有对肿瘤细胞的细胞毒作用。浓度为25mg／L的去甲斑蝥素作用48h时间后，以及浓度为125mg／L的去甲斑蝥素作用24h时间后，细胞生长抑制率均超过50.00%。因此，去甲斑蝥素对SMMC－7721细胞的抑制作用具有明显的剂量－时间相关性，越高的药物浓度和越长的作用时间可产生更大的抑制率。通过流式细胞仪测定细胞的凋亡情况，可见去甲斑蝥素可促进SMMC－7721细胞的早期凋亡和晚期凋亡，且凋亡率与剂量有相关性，随着去甲斑蝥素浓度的提高，总凋亡率相应升高。这表明去甲斑蝥素是通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制SMMC－7721细胞的生长。

半胱天冬酶家族为介导和执行肿瘤细胞凋亡的相关因子，caspase－3可破坏肿瘤细胞内的调节蛋白与结构蛋白，而bax和细胞色素C也均与细胞凋亡过程有关［12］。肿瘤细胞的细胞色素C在线粒体表达而转运至细胞质内，激活caspase－3酶原使之成为活性caspase－3发挥细胞凋亡的作用［13］。bax是细胞凋亡的重要调节因子，参与线粒体外膜的蛋白转运通道的形成，促进细胞色素C的转运，并可降低机体内原癌基因对肿瘤细胞增殖的抑制作用［14－15］。本研究结果表明，去甲斑蝥素可提高caspase－3、bax和细胞色素C的表达量，且以上三种凋亡因子的表达量与去甲斑蝥素的剂量有相关性，浓度为25、125mg／L的去甲斑蝥素处理细胞后，caspase－3、bax和细胞色素C的蛋白表达量显著提高。因此，去甲斑蝥素诱导SMMC－7721细胞凋亡的作用机制在于上调bax的表达量，促进线粒体中的细胞色素C释放入细胞质内激活caspase－3酶原为活性caspase－3，最终活性caspase－3直接执行了肿瘤细胞的早期凋亡和晚期凋亡过程。

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