绿茶多酚联合针刺治疗对鱼藤酮致帕金森病大鼠保护作用的研究

张延平 李彦改 徐晓臣 王英杰 李印杰

河北省邯郸市第一医院神经内科（邯郸056004）

帕金森病又称特发性帕金森病（Idiopathic parkinson’s disease，PD），也被称为震颤麻痹（Paralysis agitans，shaking palsy），是中老年人常见的锥体外系的神经系统变性疾病。到目前为止，PD的病因仍不清楚，目前治疗只是控制其症状，而不能根治。绿茶多酚（Green tea polyphenols，GTPs）是一类含有多酚羟基的化学物质，能够明显地清除体内的有害自由基，抑制脂氧合酶的活性和脂质过氧化作用，在许多神经系统变性疾病中显示出保护作用［1－2］。针灸具有疏通经络、调畅气血、调和阴阳之功。本研究拟采用鱼藤酮注射制备PD动物模型，探讨绿茶多酚联合针灸治疗能否对多巴胺神经元有保护和修复作用以及其作用机制。

1 材料与方法 1.1 材 料 Witstar大鼠50只，雄性，体重250～300g，购于河北医科大学实验动物中心，根据随机数字表将动物分为空白对照组（10只）、鱼藤酮组（20只）和绿茶多酚＋针刺治疗组（20只）。绿茶多酚、鱼藤酮购自Sigma公司，酪氨酸羟化酶（TH）抗体、SP试剂盒、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）购自北京中杉金桥公司。

1.2 动物的处理 在葵花籽油中溶解鱼藤酮，将混合液充分震荡混匀后，于4℃避光保存。每日按照2.0mg／kg给鱼藤酮组和绿茶多酚＋针刺治疗组的大鼠背部皮下注射，进行PD模型的建立，以大鼠出现四肢不能站立行走，翻身困难，丧失主动进食能力为造模成功。绿茶多酚＋针刺治疗组在造模成功后开始在大鼠饮水中加入GTPs，并且取筋会穴“阳陵泉”及“舞蹈震颤控制区”［3］，针刺双侧“阳陵泉”及“舞蹈震颤区”，采用提插和捻转手法刺激，每次10min，每天治疗1次。空白对照组背部皮下注射葵花油1mL／kg，其余处置各组均一样。连续观察50d后处死所有大鼠。

1.3 黑质多巴胺能神经元（Tyrosine hydroxylase，TH）计数 取空白对照组大鼠5只、鱼藤酮组和绿茶多酚＋针刺治疗组大鼠各10只。10% 的水合氯醛 （300mg／kg）腹腔麻醉动物，左心室插管快速灌注生理盐水200mL以去除血液，再灌注含4% 多聚甲醛（0.1M，PH 7.4）400mL。取脑，置相同固定液中于4℃下后固定4h。而后浸30% 的蔗糖液 （0.1M，PH 7.4PB配制）至组织块沉底，行冠状冰冻切片，片厚40μm。采用免疫组化SP法，测定在40倍物镜下1cm2面积黑质多巴胺能神经元数目。

1.4 GSH和MDA含量的测定 取空白对照组大鼠5只、鱼藤酮组和绿茶多酚＋针刺治疗组大鼠各10只，断头处死大鼠，在低温环境下迅速取出中脑黑质，投入液氮中，－80℃保存备用。实验时，组织称重、剪碎，加入冷生理盐水，其中组织重量与冷生理盐水体积按1∶9比例，放入匀浆器。匀浆器放在冰浴中，以2000转／min转速上下匀浆20次，然后吸至10mL离心管中。冰浴放置30min后，在4℃以3000转／min，离心15min。小心吸出上清，根据实验需要分别放入EP管中。参照试剂盒说明书分别测定GSH和MDA含量。

3 结 果 3.1各组黑质多巴胺能神经元计数 对照组、鱼藤酮组和绿茶多酚＋针刺治疗组中TH阳性细胞计数分别为（253.1±31.45）、（146.3±27.74）和（200.1±30.18）个／视野。与对照组比较，鱼藤酮组TH阳性细胞数明显低于对照组。经过绿茶多酚＋针刺治疗，TH阳性细胞数有明显增加，见表1。

表1 各组大鼠TH阳性细胞的表达情况

2.2 各组GSH和MDA含量测定结果 与空白对照相比，GSH含量在鱼组藤酮组和绿茶多酚＋针刺治疗组均有降低，但是绿茶多酚＋针刺治疗组的GSH含量高于鱼藤酮组，而MDA含量则相反，各组GSH和MDA含量的变化具有统计学意义，见表2。

表2 各组GSH和MDA含量的测定情况

4 讨 论 大脑是帕金森病的主要发病部位。据中医理论认为该病是风、虚、痰、瘀、精少、脏虚谓之本，内脏亏虚、气血不足，大脑髓海得不到充分的营养［4－5］。目前，临床治疗帕金森病常用的西药是左旋多巴、溴隐停、麦角卡林等，但这些药物毒副作用较大、效果不稳定，而且远期疗效不肯定。外科手术从立体定向基底节治疗，到苍白球毁损治疗，再到丘脑核团毁损术，治疗费用昂贵，并且只是改善临床症状，并不能延缓该病的发展。基因治疗的远期疗效也不确定。

绿茶是我国最常见的饮品之一，现代科学大量研究证实，茶叶含有与人体健康密切相关的生化成份，其中具有药理作用的主要成份是茶多酚、咖啡碱、脂多糖、茶氨酸等。茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇（儿茶素）类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中黄烷醇起重要作用，它主要由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）等几种单体组成［6］。近年来人们发现了GTPs对神经系统变性性疾病有保护作用，但是对GTPs神经保护作用的认识主要是通过体外细胞培养获得的。人们发现在PC12细胞培养中加入GTPs可以显著抑制神经毒性药物6－羟多巴（6－OHDA）诱导的凋亡［7］。另外，给小鼠注射神经毒素1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢 吡 啶 1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine hydrochloride，MPTP）从而建立PD模型发现，GTPs腹腔注射或口服均可明显减轻MPTP导致的中脑多巴胺神经元的丢失［8］。

本研究给大鼠注射鱼藤酮建立PD模型，并给一部分大鼠GTPs＋针灸干预，发现GTPs＋针灸组多巴胺能神经元的缺失明显低于鱼藤酮组，并且提高了 MDA的含量和活性，降低了SOD的含量。其原因是EGCG可通过能够通过血脑屏障渗入神经系统，发挥其神经保护作用。此外，有研究发现在造模前使用GTPs进行干预［9］，效果优于造模后使用。该研究认为，GTPs不仅可以提高包括神经系统在内整体内环境的抗氧化能力和清除自由基的功能，而且还具有较强的抗氧化作用，提高其病理发生改变的阈值，降低损伤程度和范围，最大程度地保护包括黑质多巴胺能神经元在内的神经系统，其效果远远优于发生病变之后的治疗性给药以修复神经的效果［10］。

GTPs在保护神经细胞、抑制氧化应激、抗兴奋性毒性、抑制细胞凋亡等方面有一定作用，针灸治疗PD无明显副作用。因此，二者联合可以作为治疗PD较理想方法。

［1］ 李 琼，李 勇.绿茶多酚防治老年神经退行性疾病研究进展［J］.卫生研究，2010，39（1）：123－126.

［2］ 李 军，辛 勤，杨 雁.绿茶多酚药理作用的研究进展［J］.中国热带医学，2014，14（1）：128－130.

［3］ 陈日新.实验针灸学［M］.北京：科学出版社，2014：134－137.

［4］ 刘宁平.中医证型辩证治疗帕金森的临床研究［J］.中医中药，2012，10（19）：334－335.

［5］ 李 强，霍 青.中医中药治疗帕金森病前景展望［J］.中医临床研究，2013，5（24）：117－119.

［6］ Mandel SA，Weinreb O，Amit T，et al.Molecular mechanisms of the neuroprotective／neurorescue action of multitarget green tea polyphenols［J］.Front Biosci（Schol Ed），2012，1（4）：581－598.

［7］ Zhao B.Natural antioxidants protect neurons in Alzheimer＇s disease and Parkinson＇s disease［J］.Neurochem Res，2010，34（4）：630－638.

［8］ Mandel SA，Amit T，Weinreb O，et al.Simultaneous manipulation of multiple brain targets by green tea catechins：apotential neuroprotective strategy for Alzheimer and Parkinson diseases［J］.CNS Neurosci Ther，2010，14（4）：352－365.

［9］ 陈 敏，黄雪芳，叶 俊，等.绿茶多酚对帕金森病小鼠多巴胺能神经元保护作用研究［J］.重庆医学，2013，42（7）：721－723.

［10］ Mandel SA，Amit T，Kalfon L，et al.Cell signaling pathways and iron chelation in the neurorestorative activity of green tea polyphenols：special reference to epigallocatechin gallate（EGCG）［J］.J Alzheimers Dis，2011，15（2）：211－222.