鸭源高产L-乳酸凝结芽孢杆菌的分离与鉴定

孟长纪，丁 轲，李 旺，李元晓，孙二刚

(1.河南科技大学 宏翔生物饲料实验室，河南 洛阳 471003；2.河南宏翔生物科技有限公司，河南 汝州 467500；3.河南省动物疫病与公共安全院士工作站，河南 洛阳 471003)



鸭源高产L-乳酸凝结芽孢杆菌的分离与鉴定

孟长纪1，2，丁 轲1，3，李 旺1，李元晓1，孙二刚2

(1.河南科技大学 宏翔生物饲料实验室，河南 洛阳 471003；2.河南宏翔生物科技有限公司，河南 汝州 467500；3.河南省动物疫病与公共安全院士工作站，河南 洛阳 471003)

为了获得高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌，从河南省汝州市的肉鸭养殖场采集50份鸭肠道黏液样品。利用分离培养基对细菌进行分离和纯化，用试剂盒检测L-乳酸产量，结合菌落形态、显微形态、生理生化试验和16S rDNA序列鉴定其种属。鉴定结果表明：从50株细菌中分离得到一株高产L-乳酸的菌株BC07，L-乳酸产量为43.2 g/L。经鉴定为凝结芽孢杆菌，能形成芽孢，而且该菌株能够耐受较强的酸、胆盐和高温。

鸭源；凝结芽孢杆菌；L-乳酸；分离；鉴定

0 引言

乳酸是一种重要的有机酸，其广泛应用于食品、医药、化妆品、烟草等行业，特别是以L-乳酸为原料来生产可降解性塑料—聚乳酸，引起广泛关注。L-乳酸因其左旋的特征，具有很好的生物相融性，能与哺乳动物相融，可直接参与人体代谢，无任何副作用。与根霉好氧发酵生产L-乳酸相比，乳酸细菌发酵具有对糖转化率高、无通气能量消耗、成本低等优点[1]。通常使用的乳酸菌株主要是粪肠球菌、屎肠球菌、乳杆菌等，这些乳酸菌抗逆性差、不耐热，而在乳酸的生产中，发酵过程中温度会升高，远远超过了生产菌种的最适生长温度，菌体生长缓慢，产酸量降低，耗糖慢，发酵周期长，影响乳酸生产率，降低经济效益。与传统的乳酸菌株相比，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)发酵生产L-乳酸有很多优点：发酵温度高，培养基不需要灭菌，生产出的L-乳酸光学纯度高等[2]。这些特性符合低能耗、高产出的生产要求。近年来，凝结芽孢杆菌利用磷酸戊糖途径发酵己糖、戊糖和木糖高效生产L-乳酸而受到广泛关注[3]。尽管凝结芽孢杆菌发酵生产L-乳酸有诸多优点，但其L-乳酸转化率和效价比乳酸菌低[4]，所以要想应用到商业生产中，还必须进一步改善凝结芽孢杆菌的L-乳酸转化率和效价。本试验旨在从鸭肠道黏液中分离筛选出高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌，为研究其最佳L-乳酸转化率和效价提供菌种支持，同时为L-乳酸的工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)样品：取汝州市河南中宏康馨农业有限公司养殖场50只健康鸭的肠道内壁黏液，编号并保存于4 ℃冰箱备用。

(2)培养基。①分离培养基(改良MRS培养基)：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，KH2PO42 g，吐温80 1.0 mL，CaCO320 g，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，α-甲基葡萄糖苷10 g，山梨酸钾1 g，水1 L，调pH值6.2～6.5。②增殖培养基,即酵母浸出粉胨萄萄糖培养基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD):葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母粉10 g，水1 L，调pH值7.0，115 ℃灭菌20 min。

(3)产酸指示培养基：在增殖培养基的基础上加入质量分数为0.02%的溴甲酚绿(pH=3.8时呈黄色，pH=5.4时呈蓝绿色，pH=4.5时开始有颜色的明显变化)。

(4)改良矿物质盐培养基：(NH4)2SO42 g，KH2PO42 g，NaCl 2 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，FeSO40.01 g，酵母粉10 g，木糖50 g，CaCO330 g，蒸馏水1 L，自然pH，115 ℃灭菌20 min。

(5)固体培养基:在液体培养基的基础上添加1.5%～2.0%琼脂(每100 mL液体培养基中添加1.5～2.0 g的琼脂)。

(6)L-乳酸检测试剂盒：购自上海必优生物科技有限公司。

1.2 方法

(1)样品的采集和处理。从河南康馨农业有限公司养殖场随机采集50只健康鸭肠道内壁黏液，编号并保存于4 ℃冰箱备用。每份样品取1 g，分别加入到装有9 mL生理盐水(生理盐水中添加1 g每100 mL的胆酸钠，然后调节pH 到3.0)的50支试管中[5]，混匀后80 ℃水浴10 min除去杂菌，然后静置5 min，待用。

(2)菌株的分离和纯化。吸取100 μL上清液涂布于分离培养基，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，待菌落长出后随机挑取有溶钙圈的疑似菌落连续进行3次平板划线。挑取单个菌落，进行革兰氏染色镜检，油镜下观察不同菌落的形态，选取符合凝结芽孢杆菌菌株显微形态的菌株进行产酸检测。

(3)产酸能力的检测和L-乳酸产量的检测。用接种环蘸取菌液，点种在产酸指示培养基上，并做好标记，37 ℃培养24 h后观察结果。若接种点周围出现褪色情况，则判定产酸，根据变色圈的大小鉴定产酸能力的强弱。挑选产酸能力较强的菌株进行L-乳酸产量检测，菌落接种到YPD液体培养基中进行活化，活化后按6%接种量(每100 mL液体培养基中接种6 mL活化好的菌液)接种到装有250 mL矿物质盐培养基的250 mL锥形瓶中，50 ℃不搅拌培养48 h。用L-乳酸检测试剂盒检测L-乳酸的生成量。

(4)生理生化鉴定。对L-乳酸产量最高的菌株进行生理生化鉴定，参照《伯杰细菌鉴定手册》[6]和《常见细菌系统鉴定手册》[7]进行。

(5)16S rDNA鉴定。生理生化鉴定后，进行16S rDNA序列测定[8]。利用Prime Premier 6.0软件，参考乳酸杆菌的16S rDNA序列为模板设计一对引物：P1:5’-AGAGTTTGA TCCTGG CTCAG-3’，P2:5’-ACGGTTACCTTGTTAC GACTT-3’。利用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取分离菌的全基因组为模板，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系(25 μL)为：12.5 μL PremixTaq( ExTaqVersion 2.0)，模板2 μL，P1、P2各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃，5 min→(94 ℃，50 s→52 ℃，90 s→72 ℃，90 s，30个循环)→72 ℃，10 min→4 ℃，保存。取5 μL PCR产物与2 μL加样缓冲液混匀，1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳，80 V电泳30 min，紫外透射仪观察电泳结果。将PCR产物送至上海生物工程技术服务有限公司测序，然后将16S rDNA序列提交到GenBank进行相似性分析，挑选相似度较高的17个株菌，利用MEGA 5.0软件进行系统发育树构建与分析。

2 结果与分析

图1 菌株显微形态图

2.1 菌株的分离纯化结果

经过改良MRS培养基初步分离，分离菌株有的呈球状，有的呈杆状，杆状菌株的营养体有的呈链状排列，有的成对，有的单个存在。当过营养培养形成芽孢后可见芽孢有的中生，有的端生，且末端膨大，有的呈空壳状。对每个菌株进行革兰氏染色并镜检，其中疑似菌株BC01显微形态见图1a，疑似菌株BC07显微形态见图1b。

2.2 菌株产酸及L-乳酸产量检测结果

将21株菌接种到产酸培养基平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，发现有12个平板上出现褪色圈，褪色圈直径D见表1。

表1 褪色圈直径和L-乳酸产量

注：D为褪色圈直径，M为L-乳酸产量。

将菌株分别接种到装有250 mL改良矿物质盐培养基的250 mL锥形瓶中，不搅拌培养48 h，L-乳酸的产量M见表1。其中，菌株BC07的L-乳酸产量最高，所以选择菌株BC07进行鉴定。

2.3 菌株生理生化鉴定结果

图2 16S rDNA片段PCR扩增结果

生理生化鉴定结果显示:菌株BC07是革兰氏阳性菌，能运动，厌氧、55 ℃、pH5.0均能生长，能发酵戊糖、蔗糖、棉子糖、海藻糖、阿拉伯糖，能水解酪蛋白，不能水解明胶，甲基红、卵黄反应、丙酸盐、柠檬酸盐试验呈阴性。参考《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步鉴定BC07属于芽孢杆菌属。

2.4 菌株16S rDNA鉴定结果

以菌株BC07基因组DNA为模板，PCR扩增后在1%(质量分数)的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图2所示。图2中，在约1 400 bp处出现明亮条带，与预期结果一致。

PCR产物测序结果显示菌株BC07的16S rDNA序列长度为1 402 bp，GenBank中的登录号为KR135825。从GenBank中挑选相似度高的17株芽孢杆菌属菌株，利用MEGA 5.0软件构建系统发育树，结果见图3。由图3可知：分离菌株BC07与凝结芽孢杆菌BacilluscoagulansIAM 12463亲缘关系最近，所以确定菌株BC07为凝结芽孢杆菌。

图3 基于16S rDNA序列构建菌株BC07的系统发育树

3 讨论

本试验分离菌株时是将样品加入到pH3.0且含有1%(质量分数)胆酸盐的生理盐水中，这一步可杀死样品中不耐酸和不耐胆盐的杂菌，再将样品80 ℃水浴10 min，除去不耐热的杂菌。这种方法处理后，减少了杂菌的干扰。菌株的鉴定是以分子鉴定(16S rDNA序列测定)为主，生理生化鉴定为辅，分子鉴定后加以进化树分析，得出的结果准确可靠。分离出的凝结芽孢杆菌比乳酸菌有很大优势，其产生的芽孢易储存、耐高温、发酵产乳酸，可有效降低发酵成本。凝结芽孢杆菌可以利用乳酸菌难以利用的原料来发酵生产乳酸，文献[9]分离出的凝结芽孢杆菌IP E22表现出很强的发酵戊糖、己糖和纤维素二糖的能力，也能耐受木质纤维素水解产生的抑制剂，可以从小麦秸秆中发酵生产乳酸。分离出的凝结芽孢杆菌BC07，L-乳酸产量在分离菌株中最高，但相比一些乳酸菌的L-乳酸产量，菌株BC07的乳酸产量还需进一步提高。通过优化发酵生产过程，控制代谢流量，在L-乳酸的工业化生产上，该菌株将很有潜力。

分离出的凝结芽孢杆菌除能应用到生产L-乳酸外，还能作为微生态制剂添加到动物饲料中。与从粪便和土壤中分离相比较，从健康鸭肠道黏膜分离出的凝结芽孢杆菌，具有更好的肠道定植能力。应用到饲料、兽药中，动物食用后能很好地在肠道定植，适应肠道内的环境，有利于更好地发挥其益生作用。凝结芽孢杆菌进入肠道后能调节肠道内微生态的菌群平衡，提高机体免疫和抗病能力，减少肠道疾病的发生。在肠道内定植后会分泌淀粉酶和蛋白酶，促进饲料的消化吸收，降低料肉比。产生的乳酸、抗菌凝固素及多种酶能抑制有害菌的繁殖，有通便、止泻作用，还可改善动物机体的免疫功能，提高抗病力[10]。文献[11]研究发现：凝结芽孢杆菌制剂能提高肉鸭平均日增质量，降低饲料质量与体质量比，提高血清中谷胱甘肽过氧化氢酶活性，同时还能提高其免疫器官指数。而且凝结芽孢杆菌作为益生菌无任何毒副作用，使用安全，在代谢过程中还能产生抑菌物质—凝结素，对胃肠道炎症有一定的治疗作用。文献[12]研究发现：凝结芽孢杆菌活菌片改善腹泻患儿的临床症状，同时也缩短了病程。可见，凝结芽孢杆菌既可用在畜禽养殖中发挥益生作用，也可用在临床上缓解胃肠道疾病。

4 结论

本试验从健康鸭肠道黏液中分离出一株芽孢杆菌BC07，该菌株高产L-乳酸，耐高温、耐酸、耐胆盐，经形态学观察、产酸检测、产L-乳酸检测、生理生化鉴定、16S rDNA测序鉴定为凝结芽孢杆菌。

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河南省科技厅重大科技攻关基金项目(131100110300);河南省教育厅科学技术研究重点基金项目(13B230987)

孟长纪(1991-),男,河南确山人,硕士生;丁轲(1977-),男,通信作者,河南永城人,副教授,博士,硕士生导师,主要从事动物微生态学方面的研究.

2015-05-07

1672-6871(2015)06-0067-04

S816.7

A