阿托伐他汀对模拟失重大鼠肺炎链球菌感染的保护作用

朱敏立,王小辉,王 萍,李月越,崔 彦



·论著·

阿托伐他汀对模拟失重大鼠肺炎链球菌感染的保护作用

朱敏立,王小辉,王 萍,李月越,崔 彦

目的 研究模拟失重状态下阿托伐他汀对上呼吸道定植菌肺炎链球菌导致肺部感染的影响，为航天员呼吸系统保护及感染治疗提供理论依据。方法 将Wistar大鼠40只随机分为4组(n=10)，分别为失重感染组(weightlessness+infection， WI)、失重感染他汀组(weightlessness+infection+statin， WIS)、对照感染组(control+infection， CI)及对照感染他汀组(control+infection+statin， CIS)。WI和WIS组采用大鼠尾吊法模拟失重状态，CI和CIS组在鼠笼内自由活动，于第3天经气管滴入肺炎链球菌悬液0.4 ml，复制大鼠肺部感染模型。从实验第1天开始他汀组(WIS组、CIS组)给予阿托伐他汀10 mg/(kg·d)药物灌胃，无药物干预组(WI组、CI组)给予等量无菌注射用水灌胃。尾吊8 d后处死动物取材，测血常规、中性粒细胞黏附分子(CD11b/c)，肺组织切片观察肺组织病理变化。结果 肉眼观察4组大鼠肺组织表面出现不同程度的局部充血及点片状出血；光镜下可见肺泡腔内大量以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，部分肺泡结构消失。上述改变以WI组表现最重，CIS组表现最轻，其中失重大鼠以上叶表现更为突出。各组间白细胞、中性粒细胞值差异有统计学意义(F=3.67，P<0.05；F=7.47，P<0.01)，WI组数值最高，CIS组最低。各组间血中性粒细胞CD11b/c比较差异有统计学意义(P<0.01)，其中WI组大鼠的CD11b/c值最高(167.75±28.39)，CIS组CD11b/c值最低(115.57±18.57)。各组间NEU百分比(NEU%)差异无统计学意义(P>0.05)。结论 模拟失重状态下肺炎链球菌所致肺部感染炎性反应更强，病理损害更重，阿托伐他汀对肺组织具有保护作用。

失重模拟；大鼠, Wistar；阿托伐他汀；肺炎链球菌

在太空环境中，重力和辐射的变化对机体多系统产生影响，呼吸系统是受失重或微重力影响较为明显的系统之一。肺除了参与气体交换，同时具有一定的免疫防御及免疫调节功能，失重时体液头向分布，导致肺血容量增加，造成“肺淤血”，不仅导致肺功能受损，同时其免疫调节及抗感染能力下降[1-2]。由于肺直接与外界相通，在上呼吸道有多种细菌定植，当免疫力低下时有可能进入下呼吸道繁殖，从而产生炎性反应。本研究观察失重对常见上呼吸道定植菌肺炎链球菌导致肺部感染的影响，同时研究该特殊环境下阿托伐他汀的作用，为航天员呼吸系统的保护及其疾病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与动物分组

1.1.1 主要仪器:FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)，KX-21全自动血液分析仪(日本希森美康公司)，台式高速离心机(无锡市瑞江分析仪器有限公司)，简易细菌浓度测定仪(法国Biomerieux公司)。

1.1.2 主要试剂: 标准肺炎链球菌菌株ATCC6303购自上海市米宝莱科技有限公司，按说明书配置成所需浓度待用。干预药物他汀类为辉瑞制药公司产品阿托伐他汀。大鼠中性粒细胞分离液试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，Anti-Rat CD11b/c PE、Anti-Rat Granulocyte Marker FITC为美国eBioscience公司产品。

1.1.3 实验动物及分组： 健康清洁级雄性Wistar大鼠40只(北京华阜康生物科技股份有限公司)，体重(280±20)g，采用随机数字表法随机分为4组，每组各为10只，分别为失重感染组(weightlessness+infection， WI)、失重感染他汀组(weightlessness+infection+statin， WIS)、对照感染组(control+infection， CI)及对照感染他汀组(control+infection+statin， CIS)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立： 动物实验经医院伦理委员会批准后进行。采用陈杰等[3]研究方法建立模拟失重动物模型：将失重大鼠(WI组和WIS组)大鼠尾部固定于笼顶，使大鼠后肢恰好离地，保持身体与地面的倾斜度为30°，悬吊8 d，CI组和CIS组大鼠于鼠笼中自由活动。4组大鼠于尾悬吊(或鼠笼自由活动)第3天经气管内滴入9×108cfu/ml的肺炎链球菌悬液0.4 ml，制作肺炎链球菌感染模型。从实验第1天开始他汀干预组(WIS组和CIS组)采用阿托伐他汀按照10 mg/kg溶于1 ml生理盐水后灌胃，每天1次，连续8 d。无他汀干预组(WI组和CI组)于同一时间以等量无菌生理盐水灌胃。

1.2.2 标本采集及检测： 于大鼠尾吊(或地面自由活动)第8天，以2%戊巴比妥钠60 mg/kg行腹腔麻醉后，经腹主动脉取血，检测血常规及中性粒细胞黏附分子(CD11b/c)表达水平，放血处死后取大鼠右肺上叶组织经4%多聚甲醛固定，行HE染色观察病理变化。取右侧支气管肺泡灌洗液送检微生物培养。参照大鼠中性粒细胞分离液说明书分离中性粒细胞，1 ml PBS溶液配成中性粒细胞悬液后，加入1 μl Anti-Rat Granulocyte Marker FITC和5 μl Anti-Rat CD11b/c PE充分混匀，室温避光20 min，流式细胞仪检测CD11b/c表达水平。

2 结果

2.1 一般情况 经气管注入细菌后第2天开始，部分大鼠出现精神萎靡，进食减少，呼吸困难，4只大鼠在实验结束前死亡，其中WI组2只，WIS组及CI组各1只。从肺泡灌洗液中均培养出所注入的肺炎链球菌，证明肺炎由所注入的细菌所致。

2.2 大鼠肺组织病理变化 4组大鼠肺组织大体标本肉眼观察可见肺组织表面不同程度地出现局部充血，部分肺组织表面凹凸不平，局部可见点片状出血；光镜下可见肺内小静脉及毛细血管充盈扩张，肺泡间隔增宽，肺泡腔内大量以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，部分肺泡结构消失。上述表现以WI组表现最重，CIS组表现最轻，同时失重大鼠(WI组及WIS组)局部肺组织表面充血和片状出血以上叶表现更为突出，见图1。

图1 光镜下4组大鼠肺组织病理学形态(HE×100)

A.对照感染组：肺泡大小不均，间隔增厚，中性粒细胞浸润；B.对照组感染他汀组：病理改变较对照感染组改善；C.失重感染组：肺泡结构基本消失，间隔明显增厚，中性粒细胞浸润；D.失重感染他汀组：病理改变较失重感染组减轻

2.3 血常规指标比较 对4组大鼠数据进行单因素方差分析，多组间比较结果显示，各组间白细胞、中性粒细胞值比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，均以WI组数值最高，CIS组最低。但各组间中性粒细胞百分比(NEU%)比较差异无统计意义(P>0.05)。两两组间比较显示，WI组大鼠的白细胞和中性粒细胞值均高于WIS组和CI组(P<0.05)；与CI组大鼠比较，CIS组大鼠中性粒细胞值降低(P<0.05)，CIS组白细胞值虽然低于CI组大鼠，但差异无统计学意义(P>0.05)，CIS组白细胞、中性粒细胞值与WIS组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 4组大鼠血常规指标的比较±s)

注：失重感染组建立失重动物模型，给予无菌生理盐水灌胃；失重感染他汀组建立失重动物模型，给予阿托伐他汀灌胃；对照感染组于鼠笼自由活动，给予无菌生理盐水灌胃；对照感染他汀组于鼠笼自由活动，给予阿托伐他汀灌胃

2.4 中性粒细胞CD11b/c表达水平 WI、WIS、CI、CIS组大鼠中性粒细胞CD11b/c表达水平分别为(167.75±28.39)、(139.48±25.77)、(140.20±30.14)、(115.57±18.57)。对4组大鼠数据进行单因素方差分析，结果显示4组间大鼠中性粒细胞CD11b/c表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)，两组间比较，结果显示：WI组大鼠中性粒细胞CD11b/c表达水平高于WIS组和CI组(P<0.05)，CIS组低于CI组(P<0.05)，CIS组和WIS组大鼠间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

随着国内外载人航天事业的飞速发展，宇航员须在脱离地球重力环境下生存和完成各种任务。失重状态下，航天员机体各器官系统将发生改变，其中肺组织是对重力改变较为敏感而容易受到损害的器官之一[4-6]。我们此前的研究证实，模拟失重状态下机体原有内环境稳态被打破，免疫系统功能异常，机体抗感染能力下降，炎性反应增强，与国内外其他学者研究发现基本一致，同时在肺损伤过程中多数细胞因子发生变化，如TNF-α及IL-6等[6-7]。

随着太空技术的发展，将有越来越多的航天员甚至普通大众进入太空，这种特殊环境对人体的影响也逐渐成为热点。研究显示太空飞行导致小鼠的脾脏及胸腺重量减低，胸腺中T淋巴细胞相关基因表达发生改变，从而影响机体免疫功能[8]。同时，模拟微重力或失重可导致机体氧化应激反应发生改变，Qu等[9]采用回旋器模拟微重力环境，显示人类神经细胞出现一系列氧化应激-适应-氧化损伤的变化。Cui等[10]实验从另一角度证实模拟失重可导致大鼠肝脏的应激反应。这种在免疫及氧化应激系统发生变化的情况下，机体容易被致病微生物入侵。

上呼吸道中通常有条件致病菌定植，如溶血性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等，一旦体内外环境发生变化时，这些细菌可下行导致肺部感染。中性粒细胞是机体防御感染的关键细胞。当呼吸系统感染时，中性粒细胞进入肺组织来清除致病原，但其同时也释放炎性递质，造成肺组织损伤[11]。CD11b/c为一种整合素，是中性粒细胞重要黏附分子之一，主要储存在胞质内，当炎性刺激(尤其是细菌毒素)时，CD11b表达上调并转移到细胞膜表面，介导其与血管内皮细胞黏附，到达炎症部位，释放有害物质，致组织损害[12]。因此，一般状况下CD11b表达水平越高提示肺组织受损越重。本研究结果证实，失重组大鼠肺部感染后，CD11b/c表达高于地面对照组肺感染大鼠，表明失重大鼠在遭受细菌感染时，该黏附分子表达增加，肺组织受损更重。

他汀类是一种重要的用来抑制胆固醇生物合成的药物，近年来该类药物的其他生物效应逐渐显现，并成为研究热点。研究显示，他汀对参与免疫及炎性反应的基因有调节效应，从而对感染和肿瘤产生保护作用[13-14]。有报道认为他汀类药物可改善肺炎患者的生存率[15]。Hennessy等[16]研究证实辛伐他汀对肺上皮细胞感染铜绿假单胞菌后，参与宿主反应的基因表达产生影响。他汀类产生这种保护作用的机制可能是通过作用于细菌和真菌表面抗原进而抑制促炎细胞因子IL-8的活化[17]。

我们研究发现，模拟失重状态下肺炎链球菌感染导致肺部炎性反应较地面自由活动大鼠更为严重，中性粒细胞及重要黏附分子之一CD11b/c可能发挥着重要作用。我们采用近年来热点研究药物他汀类对感染大鼠进行干预，结果显示失重大鼠肺部感染肺炎链球菌时，阿托伐他汀可减少肺组织损伤，降低炎性反应，起到一定保护作用，但具体机制以及是否通过CD11b/c发挥作用，尚需进一步研究。

本研究通过阿托伐他汀对失重大鼠肺炎链球菌模型进行干预，观察中性粒细胞及其黏附分子的表达，证实该药物对模拟失重下的肺感染有一定的保护作用。但人类与大鼠在生物特性上有一定差异，药物代谢特点也有所不同，因此需进一步研究以筛选有效安全的药物，为航天医疗保障提供理论依据。

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Protective Effect of Atorvastatin on Streptococcus Pneumoniae Infections in Rats under Simulated Weightless Condition

ZHU Min-lia, WANG Xiao-huia, WANG Pinga, LI Yue-yuea, CUI Yanb

(a. Department of Critical Care and Respiratory Diseases, b. Department of General Surgery, 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

Objective To investigate the effect of Atorvastatin on pulmonary infection induced by Streptococcus pneumonia in rats under simulated weightless condition, and to provide the theoretical basis for protection of respiratory system and infection therapy for astronauts. Methods A total of 40 Wistar rats were randomly divided into weightlessness + infection group (WI group,n=10), weightlessness + infection + statin group (WIS group,n=10), control + infection group (CI group,n=10) and control + infection + statin group (CIS group,n=10). The models of simulated weightlessness were established in WI and WIS groups, while the rats in CI and CIS groups were fed in mouse cages with free running space. Bacterial pneumonia models were established in the 4 groups after the rats had been fed for 3 d. WIS and CIS groups were treated with Atorvastatin 10 mg/(kg·d) via intragastric administration on the first experiment day, while WI and CI groups were treated with same volume of sterile water via intragastric injection. The rats were killed at the end of tail-suspension for 8 d. The routine blood test and level of CD11b/c of neutrophilic granulocyte in the blood samples were detected, and the pathological changes of lung tissues in slices were observed. Results In the four groups, local congestion and spot-film hemorrhage in different degrees were found in the surfaces of lung tissues by macroscopic observation; inflammatory cells were infiltrated in the interstitial alveolar space which was mainly a large number of neutrophils under the microscope, and some parts of constructions in the alveolar space disappeared. All of the above pathological changes showed that WI group was the severest, and CIS group was the least, and the changes were more prominent in superior lobe of rats under simulated weightlessness. There were significant differences in white blood cells and neutrophilic granulocyte counts in the four groups (F=3.67，P<0.05；F=7.47，P<0.01), and the values were the highest in WI group and the lowest in CIS group. There were significant differences in CD11b/c value in the four groups (P<0.01), and the value was the highest in WI group (167.75±28.39) and the lowest in CIS group (115.57±18.57). No significant differences were found in NEU percentage (NEU%) in the four groups (P>0.05). Conclusion Pulmonary infection induced by Streptococcus pneumonia in rats under simulated weight condition, is more serious in inflammatory reaction and pathological lesions, while Atorvastatin may have protective effects on lung tissues under weight condition.

Weightlessness simulation； Rats, Wistar； Atorvastatin; Streptococcus pneumoniae

全军医学科研“十二五”重点项目(BWS11J051)

100101 北京，解放军306医院呼吸与重症医学科(朱敏立、王小辉、王萍、李月越)，普通外科(崔彦)

王萍，E-mail：pingwang306hpbj@163.com

R856

A

2095-140X(2015)06-0006-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.002

2015-01-12 修回时间：2015-02-09)