中药多糖对生精细胞凋亡影响的研究进展

·综述·

中药多糖对生精细胞凋亡影响的研究进展

Research progress of flavonoids inducing tumor cell apoptosis in vitro and its mechanism

,马帅(吉林医药学院基础医学院病理教研室，吉林 吉林132013)

摘要：生精细胞过度凋亡是导致男性不育的主要原因。中药多糖在治疗男性不育方面具有较好的作用。本文就中药多糖对生精细胞凋亡的影响作一综述，以期为中药多糖在临床治疗男性不育提供更多的理论依据，并促进中药多糖的临床开发与应用。

关键词：中药多糖；男性不育；生精细胞；凋亡

文章编号：1673-2995(2015)06-0476-04

中图分类号：R285

基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目资助课题(2014544)；2014年吉林省大学生创新创业训练计划资助.

作者简介：赵东海(1975-),男(汉族)，副教授，博士.

收稿日期：(2015-07-04)

生精细胞凋亡是指生精细胞的程序性死亡，在精子发生过程中，各级生精细胞都存在此种现象，且受到多种因素的诱导调节。在正常生理条件下，这种凋亡能帮助机体清除异常精子并有利于控制精子数量，但过度则可导致少精或弱精症，是男性不育的主要原因。在当前，男性不育症发病率不断上升，它将与癌症、心血管疾病成为21世纪对人类影响最大的疾病，因此关于有效抑制生精细胞凋亡的研究显得十分重要。近年来，国内外学者在中药多糖治疗男性不育方面做了大量研究，发现其具有很好的治疗效果。现根据已有文献就其通过不同途径抑制生精细胞凋亡做一总结。

1　调节细胞凋亡途径

1.1　线粒体途径

许多研究结果都表明，线粒体在调控生精细胞凋亡过程中起着“主开关”的作用，在细胞内外的各种凋亡信号刺激下，它的膜通透性增加，释放细胞色素C(cytochrome C，Cyt C),释放到胞浆的Cyt C在dATP存在下与Apaf-1结合，形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，进而启动下游天蛋白酶的级联反应引起细胞凋亡[1]。谭秋慧等[2]以雄性SD大鼠为研究对象，观察热应激后多糖对生精细胞的影响。通过TUNEL法检测生精细胞凋亡，免疫组化法检测Caspase-3蛋白的表达，ELISA法检测睾丸组织胞质Cyt C浓度，发现与热应激组比较，各多糖组的凋亡指数均明显降低(P<0.05)，免疫组化显示生精细胞Caspase-3阳性表达明显减少(P<0.05)，胞质Cyt C浓度显著降低(P<0.05)。由以上结果推测，多糖具有减少生精细胞发生凋亡，维持生精上皮的功能的作用，而这种作用与抑制线粒体途径有密切关系。刘军等[3]研究发现，海带多糖的干预具有减少大鼠睾丸细胞发生凋亡的作用。提前应用海带多糖灌胃后，可降低由局部慢性电离辐射导致的大鼠睾丸Caspase-3的表达，而且不同程度的减轻对睾丸组织的损伤，表现为彗星拖尾率和尾长均减少，证实海带多糖具有修复睾丸损伤的作用。

1.2　死亡受体途径

死亡受体位于细胞表面，它具有与死亡配体结合，进而启动细胞凋亡程序，引发细胞发生凋亡的作用，而且死亡受体与配体的结合具有专一性的特点。在生精细胞凋亡中常由FasL/Fas系统介导，普遍认为，Fas表达于生精细胞,而FasL表达于支持细胞，当两者特异性结合时诱导细胞凋亡。并且有研究表明其在人类睾丸中的表达受激素调控[4-5]。

张迅等[6]报道，用解支原体经膀注射后制备大鼠生殖损伤模型，然后连续45 d给模型灌胃知柏地黄汤，结果显示，与正常组、知柏地黄汤组及美满霉素治疗组相比，模型组解支原体阳性率、生殖细胞凋亡率均明显增高，而且Fas和FasL的表达水平也呈增高趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。在正常组、知柏地黄汤组及美满霉素治疗组三组中，以上各项指标的差异无统计学意义。这些结果提示，知柏地黄汤具有减少解支原体引起的生殖细胞凋亡的作用，其抗生殖细胞凋亡是通过下调Fas和FasL的表达而发挥作用的。

2　调控相关基因表达

2.1　Bcl-2家族

Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡相关基因研究得最多的一类蛋白质，包含抑制和促进细胞凋亡两类功能相反的蛋白质，分别以Bcl-2和Bax为代表。在细胞凋亡的调控体系中，Bcl-2蛋白及其家族成员相互作用，并共同构成一个复杂的网络系统，抑制或启动细胞凋亡生物学活动的发生。在这其中，Bcl-2蛋白家族与线粒体之间的作用、Bcl-2蛋白家族中各蛋白的相互作用以及细胞内Ca2+浓度和氧自由的含量均与细胞凋亡的发生有密切的关系[7]。而生精细胞中，Bcl-2和Bax的比值是生精细胞凋亡的决定性因素。

李晓彩等[10]利用双酚A制备了雄性小鼠生精功能障碍损伤模型，然后观察给予不同剂量LBP后，LBP对小鼠生精功能障碍的治疗情况。研究结果显示，LBP作用后可影响生精损伤小鼠Caspase-3蛋白的表达，使Caspase-3蛋白表达量降低。而且，初级精母细胞及各级精母细胞中Bcl-2蛋白的表达含量有明显增加的趋势。在应用LBP后，阳性表达Bax的生精细胞数量也明显减少，Bcl-2蛋白与Bax蛋白比值变大，而且这种变化呈现剂量依赖性，作用效果最好的LBP剂量为200 mg/kg，证实LBP具有减少由双酚A引起的生精细胞发生凋亡的作用，作用机制与改变了Bcl-2、Bax等Bcl-2蛋白家族蛋白表达并引起下游Caspase-3的表达变化、降低生精细胞凋亡有关。

李德远等[11]用60Co-γ射线照射雄性小鼠后制备生精障碍模型，发现60Co-γ射线可导致雄性小鼠出现睾丸细胞微核率、精子畸形率及睾丸精母细胞染色体畸形率等明显升高的情况，证实60Co-γ射线照射可引起生精损伤。而LBP混合至鼠粮中饲养6周后，发现LBP组微核率、精子畸形率及睾丸精母细胞染色体畸形率等显著降低，生精细胞损伤表现得以明显的改善。同时，LBP组小鼠Bcl-2 mRNA表达升高而caspase-3 mRNA表达降低，提示LBP可以通过调节凋亡相关基因表达抑制生精细胞凋亡，缓解生殖系统损伤。

2.2　 p53基因

p53基因是一种重要的抑癌基因,野生型p53能促进细胞凋亡，在细胞正常生长过程中起着重要的调节作用。而一旦p53基因发生突变，则可诱发多种细胞发生恶性突变。p53在睾丸中主要表达于生精细胞，其编码的蛋白可从细胞浆转位至线粒体，诱导其下游与氧化还原有关的基因表达后，导致局部活性氧含量增多，进而影响线粒体的结构。这种变化引发的结果是使凋亡诱导因子从线粒体中释放出来，在细胞浆中凋亡诱导因此可激活Caspase,从而诱导自发性和损伤性生精细胞凋亡。补肾方剂何首乌饮(又名天年饮)是由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝、丹参、茯苓组成的中药复方多糖，具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。杜金凯等[12]观察天年饮对睾丸生精细胞凋亡及相关因素的影响，发现衰老大鼠血清睾酮含量明显降低(模型组与正常组比较,P<0.05),衰老大鼠睾丸p53阳性细胞率及凋亡指数明显高于正常大鼠(P<0.01)，天年饮用药组大鼠血清睾酮含量较衰老大鼠明显升高(P<0.05),天年饮用药组大鼠睾丸p53阳性细胞率及凋亡指数较衰老大鼠明显降低(P<0.05,P<0.01)，提示天年饮可以通过调节p53表达抑制凋亡，改善大鼠睾丸生殖功能。

3　调节激素平衡

曲精小管中维持较高水平的睾酮是精子发生的最重要条件。有大量研究结果证实，生精细胞发生凋亡主要原因与睾丸组织中睾酮含量的明显减少密切相关[13]。机体内睾酮的产生受下丘脑-垂体-性腺轴的调控，以负反馈的形式调节体内睾酮含量。促性腺激素释放激素(GnRH)由下丘脑分泌产生，分泌入血后作用于腺垂体，刺激腺垂体分泌产生分泌FSH和LH。生精小管上皮中的支持细胞表面有FSH的受体，受体与FSH结合后促进支持细胞合成、分泌并产生干细胞因子(stem cell factor,SCF)，SCF则可促进精子发生。LH则与生精上皮中的睾丸间质细胞受体结合后，使得睾丸间质细胞分泌产生雄激素[14]。

罗琼等[15]的研究结果显示，LBP具有改善雄性大鼠生殖功能的作用，而且可以提高血清中睾酮的水平，但与阳性对照组及正常对照组相比，其改善和提高血清睾酮的水平远低于以上两组。研究认为，LBP并不是雄激素类似物,不具有雄激素样作用，LBP发挥生精作用的主要机制是通过对下丘脑-垂体-性腺轴的反馈调节，维持体内各分泌刺激素或激素的水平稳定，如通过降低氧化应激损伤或改善微环境等来治疗由外界因素导致的生精功能紊乱，从而改善大鼠生精功能的障碍。

张艳等[16]研究显示，五味子多糖能够有效治疗由环磷胺(CTX)导致的大鼠生精功能的障碍，五味子多糖各剂量组精子密度、精子活率升高，精子畸形率降低，血清FSH和LH水平降低，睾丸组织匀浆中T含量升高，且剂量组呈剂量依赖性，组织学观察显示，五味子多糖各剂量组大鼠睾丸组织病理性损害均得到改善，提示五味子多糖可能通过促进睾丸组织再生，使激素分泌正常，恢复下丘脑-垂体-性腺轴调控作用改善生精功能。

4　清除氧自由基

在正常情况下，睾丸内氧自由基(ROS)生成与清除处在一个动态平衡状态，有重要生理意义。然而，过多的ROS将启动脂质过氧化反应,引起睾丸组织氧化与抗氧化系统失衡,导致氧化应激,从而引起睾丸组织的损伤和生精细胞凋亡，且由于生精细胞膜含有丰富的多不饱和脂肪，使生精细胞比体细胞更易受到ROS损伤。同时，有研究证实发生氧化应激时往往伴随睾酮分泌降低现象，从而两者共同引起生精细胞凋亡[17-18]。己烯雌酚(DES)是一种人工合成雌激素，对雄性生殖系统有毒害作用，相关研究显示，DES组小鼠睾丸重量与睾丸脏器系数显著降低，小鼠睾丸组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷甘过氧化物酶(GSH-Px)活力显著下降而丙二醛(MDA)含量上升[19]。黄芪多糖(APS)、LBP分别是黄芪和的重要组成成分，有研究证实这两种重要多糖对DES诱导的小鼠生殖损伤有显著缓解作用。其力根等[20]观察到经APS灌胃后的DES小鼠睾丸组织中SOD、GSH-Px活力均高于DES组，差异显著，其中100 mg/kg组最高，MDA含量均低于DES组，差异显著，其中60 mg/kg组最低，血清中T、LH、GnRH的含量均显著增加。张彩利等[21]给DES小鼠服用LBP观察到小鼠血清SOD、GSH-Px升高，MDA下降，激素水平也有了明显回升，以50 mg/kg作用最为显著。60Co-γ射线辐射期间给予LBP，LBP各剂量组均可增加生殖系统损伤后大鼠睾丸组织SOD活性，降低MDA含量，其中以10 mg/kg剂量效果最好。这些都提示APS、LBP通过增加小鼠体内SOD水平，提高清除超氧阴离子自由基的能力，使机体总的清除ROS的能力上升，减轻ROS对生精细胞的损伤[22]。另外，已有许多文献报道都表明了中药多糖如山茱萸多糖，乌贼墨多糖，海带多糖，灵芝多糖，人参多糖可能通过抗氧化作用缓解各种因素,如高温辐射等导致的生精细胞损伤。

5　小　结

中药多糖作为中药主要有效成分之一，来源广，毒副作用小，且又具有确切的调控生殖细胞凋亡的作用，为临床研发治疗男性不育药提供了方向。但是由于中药多糖本身结构的复杂性以及受实验技术水平的限制，关于其在治疗男性不育症调控生精细胞凋亡准确机制上尚有许多未得以阐明，根据前面所述，我们也可以看到它对凋亡作用是多环节、多靶位、多途径的。因此，笔者认为进一步加强中药多糖对生精细胞凋亡的基础研究，加大对中药多糖构效和组效的研究，不仅对深入了解中药多糖抗凋亡作用机制，治疗不育有重要的理论意义，而且可进一步指导中药多糖类新药的研制和开发。

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