五味子乙素对HepG2细胞凋亡及Hsp-70基因表达的影响

·论著·

五味子乙素对HepG2细胞凋亡及Hsp-70基因表达的影响

李正祎1，于

2，张雪3，代龙光3，蒋明凤3(

吉林医药学院:1.检验学院，2.2011级药物制剂本科班，3.2012级临床输血本科班,吉林 吉林132013)

摘要：目的探讨五味子乙素(Sch B)对人肝癌HepG2细胞的抑制作用，并研究其可能机制。方法10、25、50、75、100 μmol/L Sch B作用于HepG2细胞，通过MTT法筛选低毒性的Sch B浓度，梯度浓度Sch B作用HepG2细胞48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态；MTT法检测细胞活性；Western blot法检测Sch B作用HepG2细胞48 h后不同浓度组热休克蛋白-70(Hsp-70)的表达情况；流式细胞仪检测细胞凋亡及周期改变。结果Sch B能够抑制HepG2细胞的生长，并呈浓度依赖性；流式细胞术结果显示10、25 μmol/L Sch B组细胞在Sub-G1期明显高于阴性对照组(P<0.05)。结论Sch B促凋亡机制可能与下调Hsp-70蛋白的表达有关；如做免疫调节剂与其他抗癌药物联合使用最佳给药浓度为10 μmol/L。

关键词：HepG2细胞；五味子乙素；热休克蛋白-70

文章编号：1673-2995(2015)06-0401-04

中图分类号：R73-3

作者简介：李正祎(1975-)，男(汉族)，副教授，博士.

收稿日期：(2015-07-04)

Effect of schisandrin B on cell apoptosis and Hsp-70 gene expression in HepG2 Cells

LI Zhengyi1,YU Ting2,ZHANG Xue3,DAI Longguang3,JIANG Mingfeng3(1.Academy of Laboratory,2.2011 Pharmaceutical Class of Department of Pharmacy,3.2012 Transfusion Class of Department of Medical Laboratory,Jilin Medical University,Jilin City，Jilin Province,132013,China)

Abstract:Objective To explore the inhibition effect of different concentration schisandrin B(Sch B) on HepG2 and its mechanism. MethodsCultivating HepG2 cells with 10,25,50,75,100 μmol/L Sch B respectively,the MTT method was employed to screened the low toxicity concentration of Sch B.After cultivating with the above gradient concentration schisandrin B,the stereochimical structure of HepG2 cells were observed by invert microscope and its activity was detected by MTT method and western blot was utilized to observe the expression of Hsp-70.The apoptosis condition and cell cycle were detected by flow cytometory. ResultsSch B had anti-proliferation effect on HepG2 cells growth in dose-dependent manner.The results of flow cytometry showed that the percentage of HepG2 in sub-G1 phase in 10 μmol/L and 25 μmol/L Sch B group were significantly increased than that in negative control groups (P<0.05). ConclusionThe mechanism of HepG2 cell apoptosis induced by Sch B is probably associated with the down-regulation of Hsp-70 protein expression.The best concentration was 10 μmol/L when the Sch B,as the immunomodulator,is combined with other anticancer drug.

Key words:human hepatocellular carcinoma HepG2 cell;schisandrin B;heat shock proteins-70

五味子为木兰科植物五味子的成熟干燥的果实，被称为最著名的滋补性中药，由于其果实甘、酸、辛、苦、咸五味俱全,故名五味子[1]。五味子乙素(schisandrin,Sch B)通过对大鼠口服给药后观察，其体内的主要代谢途径首先是经肝脏代谢，其次是经肾

脏代谢，并且同时存在肝肠循环代谢[2]。Sch B作为传统中药的一种活性成分，具有多方面作用。Sch B可对阿霉素引起的肿瘤细胞凋亡有促进作用[3]；Sch B可促进多柔比星诱导肝癌细胞(SMMC-7721)凋亡[4]；Sch B联合顺铂能更好的抑制H22移植瘤的增值，并促进Caspase3、8、9表达而促进其凋亡[5]。本实验拟通过Sch B作用于HepG2细胞后，细胞形态变化、细胞存活率、细胞凋亡水平、热休克蛋白-70(Hsp-70)基因表达水平等相关指标探索Sch B抑制肝癌细胞生长情况。

1　材料与方法

1.1　材　料

HepG2细胞(人肝癌细胞)来源于本实验室；Sch B购于成都普菲德生物技术有限公司，纯度为98%；四甲基偶氮唑盐(MTT)购于Amresco公司；RPMI-1640培养液购于GIBCO公司；胎牛血清购于Hyclone公司；Hsp-70购于中杉金桥公司；二甲基亚(DMSO)购于Solarbio公司；酶标仪型号为PI-3502G(北京普天新桥技术有限公司)；流式细胞仪型号为Epics XL(美国贝克曼公司)。

1.2　HepG2细胞培养

37 ℃、5%条件下，用含10%FCS的1640培养基培养HepG2细胞，用0.25%的胰酶消化传代。

1.3　MTT法检测不同浓度Sch B对细胞的毒性作用

取对数期的HepG2细胞以2×104/孔接种于96孔板，培养24 h后，分空白对照组、Sch B 10、25、50、75、100 μmol/L组，每组设3个复孔；培养24 h后用MTT法进行检测，并计算Sch B对人肝癌细胞生长的抑制率IR，公式：IR=(1-药物组A值/对照组A值)×100%，选择抑制率IR<10%的低毒性最佳Sch B浓度进行下一步实验。

1.4　形态学观察

将对数期的HepG2细胞以1×105/孔接种于六孔板，在37 ℃、5%的CO2培养箱中培养24 h,换成无血清的1640培养基，继续培养4 h后给药，实验分对照组，10、25、50、100 μmol/L浓度Sch B组，给药后48 h，在倒置显微镜下观察并拍照。

1.5　FCM检测细胞凋亡

取对数期HepG2细胞，以1×105/孔接种于六孔板中，培养24 h后，换成无血清的1640培养液，4 h后进行给药，实验分为0、10、25 μmol/L Sch B组；培养48 h后收取细胞，将每孔收取的细胞用5 mL 80%的甲醇(-20 ℃下)固定12 h，用流式细胞仪检测，并分析图谱。

1.6　Western blot检测蛋白质的表达

取对数期HepG2细胞，以1×105/孔接种于六孔板，培养24 h后，换成无血清的1640培养液，4 h后给药，分组同上，继续培养48 h后根据细胞浓度加细胞裂解液进行蛋白的提取，然后进行超声处理，最后用BCA法对蛋白进行定量。用60 μg/孔蛋白量上样，10% SDS-PAGE分离，通过电转移法将蛋白质转移到PVDF膜后，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h。加入一抗(1∶500鼠抗人Hsp-70、β-actin)4 ℃孵育过夜，TBST漂洗(5 min×3次)后，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的1∶3 000羊抗鼠IgG) 室温孵育2 h，TBST充分漂洗(5 min×3次)，化学发光试剂反应2 min，X光片暗室曝光，常规显影、定影。

1.7　统计学方法

2　结　果

2.1　MTT法检测不同浓度Sch B对细胞的毒性作用

Sch B按浓度为10、25、50、75、100 μmol/L分为5组，用MTT法所检测的细胞生长抑制率IR结果如图1所示，Sch B对细胞的抑制作用随着浓度增高抑制作用增强，并呈浓度依赖性，虽然10、25 μmol/L Sch B对HepG2细胞均有不同程度的抑制作用，分别为6.8%和10.5%，但50、75、100 μmol/L Sch B对HepG2细胞的抑制作用明显增大。因此选用10、25 μmol/L Sch B浓度进行下一步实验。

图 1　不同浓度Sch B对HepG2细胞抑制率测定

2.2　细胞形态学观察

倒置显微镜下观察可见对照组的未给药细胞较密集，且细胞间的连接较为紧凑，透光度较好;但在给药浓度为10、25 μmol/L时，细胞间有明显的空隙，细胞呈椭圆形，但细胞数目并未有明显的改变;在浓度为50 μmol/L时，细胞形态呈细长型，连接较疏松，细胞数目明显减少(图2)。

A.Control组；B.10 μmol/L Sch B组；C.25 μmol/L Sch B组；D.50 μmol/L Sch B组

图2不同浓度Sch B作用HepG2细胞形态变化

2.3　Sch B对HepG2细胞凋亡的影响

结果如图3所示,10、25 μmol/L Sch B处理48 h后,HepG2细胞在流式细胞仪的DNA含量直方图中出现Sub-G1峰,即凋亡细胞；10 μmol/L Sch B组HepG2细胞Sub-G1期达12.95%，25μmol/L Sch B组HepG2细胞Sub-G1期23.98%，均显著高于阴性对照组(0 μmol/L Sch B组)的Sub-G1期1.95%(P<0.05)。

1.Control组；2.10 μmol/L Sch B组；3.25 μmol/L Sch B组

图3HepG2细胞经Sch B干预后细胞周期的变化

2.4　Western Blot实验结果

Western blot结果显示(如图4)HepG2细胞株上Hsp-70的含量测定结果呈梯度，随着Sch B浓度的升高Hsp-70蛋白表达量逐渐减少，表明Sch B能抑制HepG2细胞Hsp-70蛋白表达。

3　讨　论

肝癌是威胁人类生命的常见疾病，发展中国家的发病率更高，且治疗非常困难。Sch B药理成分是五味子成熟干燥果实经脱脂后提取的木质素类药理活性物质，具有多方面作用。五味子在临床上可用于肝

1.Control组；2.10 μmol/L Sch B组；3.25 μmol/L Sch B组

图4Sch B对HepG2细胞Hsp-70蛋白表达的影响

癌、胃癌等的治疗，进一步深入研究发现其作用机制与五味子能抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡有关[6]。本研究利用HepG2细胞体系，使用纯化的Sch B作用于细胞，并从药效学角度观察其对HepG2细胞凋亡的影响。

本研究发现，MTT及流式细胞术结果显示Sch B能够显著抑制肝癌细胞的增殖，并呈现一定的剂量依赖性。流式细胞技术检测细胞中DNA含量的实验中发现，应用了Sch B后，处于S期(DNA合成期)细胞的比例显著减少，凋亡峰出现在了G1期(DNA合成前期)之前，这提示Sch B可能将肝癌细胞周期阻滞在Sub-G1期，抑制了DNA的合成，从而达到抑制或延缓肝癌进程的作用。在流式细胞检测结果的提示下，我们关注了Sch B诱导肝癌细胞凋亡的作用。

Hsp是一种进化上非常保守的蛋白质家族，广泛分布于各种生物体内，能够防止未折叠的蛋白质变性和促进聚集的蛋白质溶解复性，同时促进新生多肤链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等。Hsp-70在肿瘤组织中大量表达，为肿瘤生长所必需。Hsp通过与癌基因的表达产物或者肿瘤相关蛋白相互结合而发挥作用,介导癌蛋白构象成熟及转运,维持癌蛋白的结构与功能完整，参与肿瘤的发生发展。早在1995年，Ralhan等采用ELISA法和免疫组织化学方法第一次证实了Hsp-70的表达量与肿瘤的恶性程度成正比[7]。在李华民等[8]报道中HCC及癌旁肝组织中均有Hsp-70的表达。尹燕明等[9]报道在肝癌中Hsp-70阳性率为71.0%，显示在肝癌中Hsp-70高度表达。

本研究发现Sch B能降低HepG2细胞内Hsp-70表达，降低了Hsp-70对大量癌基因产物的保护，不能有效的维持癌蛋白的三级空间结构，癌蛋白无法发挥正常效应，抑制了癌细胞的活性。同时如将Sch B今后作为免疫调节剂与其他抗肝癌药物联合使用其最佳给药浓度约为10 μmol/L。

总之Sch B可以对HepG2细胞起到增殖抑制作用，其抑瘤活性的具体机制需要进一步研究。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:人民卫生出版社,2010:61-62.

[2]Zhu Heyun,Zhang Xiurong,Guan Jiao,et al.Pharmacokinetics and tissue distribution study of schisandrin B in rats by ultra-fast liquid chromatography with tandem mass spectrometry [J].J Pharm Biomed Anal,2013,78/79:136-140.

[3]李玲.五味子乙素增敏葱环类的抗肿瘤作用和减轻其心肌毒性的体内外实验研究[D].杭州:浙江大学,2006.

[4]顾颖,李凌.五味子乙素促进多柔比星诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡的研究[J].实用肿瘤杂志，2006,21(5):412-416.

[5]吕冬霞，崔健，刘月霞,等.五味子乙素联合顺铂对H22荷瘤小鼠存活时间的影响[J].黑龙江医药科学，2008,31(5):9-10.

[6]Liu Xiaoni,Zhang Chengyu,Jin Xiudong,et al.Inhibitory effect of schisandrin B on gastric cancer cells in vitro[J].World J Gastroenterol,2007,13(48):6506-6511.

[7]Ralhan R,Kaur J.Differential expression of Mr 70000 heat shock protein in normal,premalignant,and malignant human uterine cervix[J].Clin Cancer Res,1995，1(10):1217-1222.

[8]李华民，张晓丽，胡沛臻，等.肝癌及癌旁肝组织中P53蛋白及热休克蛋白70的表达及意义[J].陕西医学杂志,2001,31(8):681-683.

[9]尹燕明，秦庆亮，赵晶，等.肝细胞癌热休克蛋白70过表达与自发性癌细胞凋亡[J].中华肝脏病杂志,2001,9(2):84-85.