发芽甜荞种子粉混合金荞茶粉的糖化工艺优化

尉 杰，黄小燕，陈庆富

（贵州师范大学 荞麦产业技术研究中心，生命科学学院 植物遗传育种研究所，贵州 贵阳550001）

荞麦（Buckwheat）属蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）一年生或多年生双子叶草本植物［1］，起源于我国西南地区。荞麦是药食同源的作物，具有独特的食疗、保健作用，在降“三高”、增强机体免疫力、抗氧化、抗衰老以及改善亚健康状态等方面都有积极的作用，具有较高的开发价值。荞麦中主要的活性物质为黄酮类化合物，甜荞种子的黄酮类化合物含量一般在0．02%～0．789%，苦荞在1．08%～3．6%［2］。同时荞麦种子中淀粉含量达60%以上［3］，是一种良好的酿酒原料。使用甜荞麦经液化发酵，可酿制出酒精度在10%～14%Vol的荞麦酒［4］。

金荞麦（Fagopyrum cymosum complex）为荞麦属（Fagopyrum Mill）植物［1］。金荞麦叶和花中的黄酮类物质较高，分别达5%和10%以上，野生金荞麦中的生物类黄酮、氨基酸、维生素、微量元素等含量均高于苦荞和甜荞。金荞茶由金荞麦叶经发酵加工而成，含有丰富的营养保健成分［5－6］，金荞茶浸泡后的茶汤亦含有丰富的黄酮及可溶性蛋白。在荞麦酒的酿制研究中发现，采用单一甜荞麦作为原料，荞麦酒中的营养成分有限，由于金荞麦茶含有丰富的营养成分，在荞麦酒的酿制中添加金荞茶可丰富荞麦酒中的营养成分，提高荞麦酒的保健价值，对荞麦酒品质改善具有积极作用。

荞麦酒发酵过程中，微生物只能分解利用其中的还原糖将其转化为酒精，而糖化是将谷物中淀粉分解为微生物可利用的还原糖的过程。荞麦样品中还原糖含量为仅为0．56%［7］，还原糖含量较低，从而导致荞麦酒的酒精度较低。在前期预试验中发现，金荞茶粉经过糖化后发酵所得发酵液酒精度在6%～7%，未经糖化的试验组发酵液酒精度在4%，表明金荞茶粉在经糖化后可发酵程度较高，为提高荞麦酒的品质，提高其酒精度，试验采用混合后共同糖化的方式对添加金荞茶的发芽甜荞麦种子粉进行糖化工艺的研究。

1 材料与方法

1．1 材料

丰甜1号甜荞种子：贵州师范大学生命科学学院植物遗传育种研究所荞麦产业技术研究中心提供；金荞茶：由贵州师范大学生命科学学院植物遗传育种研究所荞麦产业技术研究中心培育、栽培于贵阳市永乐乡贵州师范大学柏杨实验基地的金荞麦“金荞1号”经发酵加工制得的金荞麦叶发酵茶；糖化酶：北京索莱宝科技有限公司；安琪酵母酿酒曲：市售；柠檬酸、甲醇、3，5－二硝基水杨酸、NaOH、丙三醇、碘化钾、HCl等均为分析纯。

仪器与设备：LRH－800－G 型光照培养箱（广东省医疗器械厂），755B型紫外可见分光光度计（上海金鹏有限公司），WGL－45（B）型电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司），pHS－3C 型pH 酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司），AR1140 型电子分析天平（奥豪斯国际贸易上海有限公司）。

1．2 原料制备

使用粉碎机将金荞麦叶发酵茶打粉，粉末直径约0．5～0．8mm，将丰甜1号荞麦种子发芽3～5d，待芽长约0．5cm 时烘干打粉备用。

1．3 金荞茶粉添加量的确定

由于金荞茶粉由金荞叶制成，淀粉含量较低。试验发现纯金荞麦叶发酵茶粉经糖化发酵后酒精度在6%左右，过量添加金荞茶粉将会影响酒液酒精度，同时为了兼顾材料成本，以所酿原酒酒精度作为限制金荞茶粉添加的主要指标。分别以10%、15%、20%、25%、35%的荞麦茶粉添加量进行发酵试验，以1∶4的料水比添加6%的安琪酵母酿酒曲在30℃下发酵8d，重复2次

1．4 糖化

将金荞麦叶发酵茶粉与荞麦发芽种子粉按一定比例混匀后加热蒸熟，调节温度、pH、添加糖化酶进行糖化。

1．4．1 各影响因素的考察

1）糖化温度。温度主要通过影响糖化酶的活性来影响还原糖含量，根据糖化酶最适温度设计糖化温度分别为55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，使用柠檬酸调节pH 为4，糖化酶添加量6%，糖化时间为70min，重复2次，下同。

2）pH 。pH 通过影响糖化酶的活性来影响还原糖含量，根据糖化酶最适pH 设计糖化pH 分别为3．5、4、4．5、5、5．5、6，温度为60℃，酶添加量为6%，糖化时间为70min。

3）糖化酶添加量。酶添加量过少将不能满足催化反应的需要，过多会促使复合反应的发生使还原糖含量下降。根据已报道的类似试验，设计酶添加量分别为3．5%、4%、4．5%、5%、5．5%、6%，pH 为4，温度为60℃，糖化时间70min。

4）糖化时间。糖化时间过短则糖化反应不充分，还原糖含量过低；糖化时间过长，则糖化酶失去活性，还原糖含量不再增加。设计糖化时间分别为30min、40min、50min、60min、70min、80min，pH4，酶添加量为6%，温度为60℃。

1．4．2 响应面设计 在单因素试验的基础上，选定糖化温度、糖化pH、酶添加量作为响应面试验设计中的三个因素，糖化时间统一定为70min。根据单因素试验结果采用Design－Expert 8．0．6软件设计Box－behnken响应面试验，其因素水平见表1。

表1 发芽甜荞种子粉混合金荞茶粉的糖化试验因素与水平Table 1 Factors and levels of saccharification experiment of buckwheat seed powder with golden buckwheat leaf fermented tea

1．5 理化指标的测定

酒精度计法测定酒精含量、DNS法测定还原糖含量［8］。

1．6 葡萄糖标准曲线的制备

采用紫外分光光度计法测定糖化液中还原糖含量（以葡萄糖计），制作葡萄糖标准曲线。取7 支25mL具塞刻度试管编号，按表2分别加入浓度为1mg／mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3，5－二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长520nm，用0号管调零点，测出1～6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，得标准曲线回归方程为y＝0．985 8x＋0．014 6，R2＝0．9975。

表2 葡萄糖标准曲线制作Table 2 The dosage of reagent when making glucose standard curve

2 结果与分析

2．1 不同金荞粉添加量的酒精度

由于试验所用金荞茶由金荞麦叶制成，因此其淀粉含量要远低于荞麦粉，添加金荞茶粉后势必会对发酵所得酒液酒精度有一定程度的影响。由图1可见，随着金荞茶粉添加量的提高，发酵所得酒液酒精度不断下降，且酒液经后期处理酒精含量会有一定损失，为保证成品酒液酒精含量，以及缓冲操作工艺对最终酿得酒液酒精含量的影响，采用20%的金荞茶粉添加量进行糖化试验。

图1 不同金荞茶粉添加量的酒精度变化Fig．1 Variation alcohol degree with different adding amount of golden buckwheat tea powder

2．2 不同因素对发芽甜荞种子粉混合金荞茶粉还原糖含量的影响

由图2可看出，随着糖化温度的提高，还原糖含量先上升后下降，在65℃左右达最高值。随着糖化pH 的提高，还原糖含量同样先上升后下降，在pH4．5左右时达最高值。随着糖化酶添加量的增加，还原糖含量先上升然后趋于平稳，并有小幅下降，在糖化酶添加量约4．5%时达最高值。随着糖化时间的延长，还原糖含量不断上升，在60 min后再延长糖化时间还原糖含量几乎保持稳定。

图2 不同糖化温度、pH、酶添加量、时间的发芽甜荞种子粉混合金荞茶粉还原糖含量Fig．2 Content of reducing sugar of different saccharification temperature，pH，enzyme dosage，time ofgermination buckwheat seed powder mixed with golden buckwheat tea powder

2．3 响应面法优化发芽甜荞种子粉混合金荞茶粉的糖化工艺

采用Design－Expert 8．0．6软件对不同处理发芽甜荞种子粉混合金荞茶粉的还原糖含量（表3）进行分析，通过多元回归拟合分析，得到以还原糖含量为因变量，糖化温度、糖化pH、糖化酶添加量自变量的回归方程模型为：y＝24．62＋1．53 x1＋1．15x2＋0．55 x3－0．13 x1x2－0．28 x1x3－0．17 x2x3－5．77 x12－2．17 x22－1．52 x32，对该模型进行方差分析可知，该模型P＜0．000 1极显著，具有统计学意义，失拟值P＝0．894 1＞0．1，说明方程具有较好的拟合程度，分析结果可靠。模型一次项x1、x2、x3，P 值均小于0．001 其显著性为极显著，交互项x1x2、x1x3、x2x3的P 值分别为0．049 7、0．001 2、0．012 8，达显著水平，二次项x12、x22、x32P 值均小于0．000 1，达极显著水平。x1、x2、x3的F 值分别为1 669．679、949．487、217．180，因此各因素对还原糖含量影响的大小为糖化温度＞糖化pH＞糖化酶添加量。

2．4 各因素间的交互作用

为直观分析各因素对糖化所得还原糖含量的影响，根据所得回归方程建立等高线图及响应曲面图。图3～5 依次为酶添加量6%、糖化pH 5、糖化温度60℃的因素间交互作用的响应面与等高线图。

表3 不同处理发芽甜荞种子粉混合金荞茶粉的还原糖含量Table 3 Content of reducing sugar of different saccharification conditions germination buckwheat seed powder mixed with golden buckwheat leaves fermented tea powder

由图3～5可知，等高线图中最高值等高线均接近闭合或闭合，最佳糖化工艺在试验设计范围内。响应面图及其等高线显示，还原糖获得量随各两因素的增加呈先上升趋势随后略有下降。等高线的形状为椭圆形时表示交互作用强为圆形时表示交互作用弱。图3～5显示，各因素之间均有交互作用，糖化温度与pH 之间的交互作用与糖化温度与酶添加量之间的交互作用均较强，糖化pH 与酶添加量的交互作用稍弱。

图3 糖化时间与pH 对还原糖含量影响的响应面与等高线图Fig．3 The response surface and contour map of the effect of saccharification time and pH on the content of reducing sugar

图4 糖化温度与酶添加量对还原糖含量影响的响应面与等高线图Fig．4 The response surface and the contour map of the effect of saccharification temperature and adding amount of enzyme on the content of reducing sugar

图5 糖化pH 与酶添加量的对还原糖含量影响的响应面与等高线图Fig．5 The response surface and the contour map of the effect of saccharification pH and adding amount of enzyme on the content of reducing sugar

2．5 最佳工艺条件的确定及验证

使用Design－Expert 8．0．6软件对所得回归方程进行分析，获得最佳糖化工艺为糖化温度65．63℃，糖化pH 4．63，糖化酶添加量5．15%，还原糖最高含量理论预测值为24．904 9%。根据此最佳工艺条件进行验证试验，由于仪器设备精度以及操作问题可能无法准确按照最佳理论工艺进行试验，设置糖化温度位65．6℃，糖化pH 为4．6，糖化酶添加量为5．15%，进行3 次平行试验，还原糖平均含量为24．83%，与理论预测值较为接近。

3 讨论与结论

经试验得出，发芽甜荞种子粉混合金荞茶粉的最佳糖化工艺为糖化温度65．63℃，糖化pH4．63，糖化酶添加量5．15%，还原糖最高含量理论预测值为24．9049%。对此条件进行验证，由于仪器精度的缘故，设置糖化温度位65．6℃，糖化pH 为4．6，糖化酶添加量为5．15%，还原糖平均含量为24．83%。

彭 海 文［7］、陈 楠［9］、裴 剑 飞［10］等 均 通 过 正 交 试验对荞麦种子粉糖化工艺进行研究。本研究首次对发芽甜荞种子粉混合金荞茶粉进行糖化工艺研究，并通过Box－behnken试验建立数学模型对甜荞麦糖化过程进行模拟。彭海文研究中还原糖含量约在30%左右，比试验高出约5%，原因可能是本研究所用材料为发芽甜荞粉，发芽过程会减少淀粉含量，且试验中添加了淀粉含量较低的金荞麦酵茶粉，由此导致糖化之后醪液中还原糖含量有所降低。本文所得最佳工艺中酶添加量为5．15%，与陈楠的研究相比酶添加量较少（最适酶添加量6%），其原因为本试验采用原料淀粉含量低于甜荞麦直接打粉为原料的淀粉含量，5．15%酶添加量即可满足本试验需要。同时，彭海文试验中糖化时间为40 min，而通过单因素试验可看出，本试验40min并未达到还原糖含量的最高值，故本试验将糖化时间延长到70 min，也在一定程度上提高了还原糖的含量。本研究还发现各因素对还原糖含量影响的大小为糖化温度＞糖化pH＞糖化酶添加量。所得甜荞麦发芽种子粉在添加金荞麦叶发酵茶后的糖化过程最佳工艺对发酵工艺研究有一定的指导意义。

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［4］ 尉 杰，陈庆富，郭菊卉．普通荞麦发芽种子的液态发酵荞麦酒工艺研究［J］．中国酿造，2014（8）：43－46．

［5］ 顾亮亮，陈庆富．金荞叶茶的冲泡条件研究［J］．食品研究与开发，2014（3）：59－64．

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［8］ 王俊丽，聂国兴，李素贞，等．DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定［J］．河南农业科学，2010（4）：115－118．

［9］ 陈 楠，陈庆富．荞麦酒糖化及酿制工艺的优化［J］．贵州农业科学，2014，42（1）：195－198．

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