姜黄素对心脏成纤维细胞增殖的研究

杨蕙宇

(西安医学院临床医学院技能教研室，西安 710021)

姜黄素对心脏成纤维细胞增殖的研究

杨蕙宇

(西安医学院临床医学院技能教研室，西安 710021)

目的:探究姜黄素在AngII诱导的心脏成纤维细胞大量增殖和CTGF、PAI-1过表达中的影响，探讨姜黄素与心脏成纤维细胞增殖的关系。方法:心脏成纤维细胞原代的培养，分别用倒置显微镜及免疫组织化学法对原代心脏成纤维细胞进行监测，用MTT法测定不同浓度姜黄素(0～100 μmol/L)对心脏成纤维细胞活性的影响，用MTT法检测不同浓度姜黄素对心脏成纤维细胞增殖能力的影响，用real-time PCR检测CTGF、PAI-1mRNA，用western-blot法分析不同浓度姜黄素对各组心脏成纤维细胞CTGF、PAI-1表达的影响。结果:在0～60 μmol/L范围内，姜黄素未显示明显的细胞毒性，因此在后续试验中我们选择5、10、30 μmol/L浓度姜黄素进行试验，试验说明姜黄素可以有效的抑制AngII诱导的心脏成纤维细胞增殖，并具有浓度依赖性，可以有效地抑制AngII诱导的CTGF和PAI-1表达。结论:姜黄素能够有效地抑制AngII诱导的心脏成纤维细胞过度增殖和CTGF、PAI-1 mRNA与蛋白的过表达，从而起到抗增殖作用。

姜黄素;血管紧张素-II;心脏成纤维细胞;纤维化

姜黄素是一种天然色素类物质，富含于姜科植物块茎中，是一种被广泛使用的调味品。此外，很早姜黄素就被收入中国和印度的草本方剂中，用于治疗多种疾病。现代医学认为，姜黄素具有抗炎［1］、抗肿瘤、抗纤维化和心血管保护［2］等多种生物学效用。目前已有试验证实，在多种常见致纤因素导致的肺部和肾脏等器官纤维化病变中，姜黄素均显示出显著的抗纤维化作用。Smith MR［3］等发现，姜黄素可以抑制肺部成纤维细胞的增殖，从而减轻博来霉素诱导的肺部纤维化。姜黄素还可以通过抑制TGF-β通路的激活和上调抗炎因子HO-1的表达，减轻肾脏纤维化的程度［4］。迄今为止，姜黄素对心脏纤维化的发病作用尚不明确。本研究我们拟在基因和蛋白的水平研究姜黄素对AngII诱导的心脏成纤维细胞增殖的能力，以探讨姜黄素与心脏纤维化的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

出生1～2 d的SD大鼠雌雄不限，由西安交通医学院医学院实验动物中心提供。姜黄素粉末纯品购于美国Sigma公司，兔抗大鼠PAI-1多克隆抗体由美国Abcom公司提供，兔抗大鼠CTGF多克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供。

1.2 研究方法

1.2.1 心脏成纤维细胞原代培养 选择出生1～2 d的SD大鼠乳鼠15只分离心脏组织，4℃ DHanks中反复漂洗，摘取左心室部分约1～2 mm3大小的组织块，用5 g/L的胰酶对其消化;采用差速贴壁法分离心脏成纤维细胞。使用3～7代的细胞进行实验并用倒置显微镜对原代培养细胞进行鉴定，免疫组织化学法检测。

1.2.2 姜黄素溶液配制 姜黄素粉末纯品购于美国Sigma公司，使用DMSO溶解，制成10 mmol/ L保存浓度，放置于-20℃冰箱内长期储存，使用时再稀释成相应浓度。

1.2.3 细胞活性测定 取对数生长期、生长状态良好的心脏成纤维细胞，以4×104个/mL浓度接种于96孔板中，每孔150 μL。细胞贴壁融合80%～90%后，以不同浓度(10、20、40、60、80、100 μmol/ L)的姜黄素处理24 h弃去培养液，每孔中加入MTT (5 mg/mL)20 μL，继续孵育4 h，吸去上清液，每孔中再加入150 μL的DMSO溶解结晶颗粒，490 nm测定各组吸光度值(OD490)。以正常对照组细胞活力为100%，其余各组细胞活力按以下公式计算:活细胞率(%)=。

1.2.4 姜黄素对AngII刺激的心脏成纤维细胞增殖能力的影响 取对数生长期、生长状态良好的CFs细胞，以4×104个/mL浓度接种于96孔板中，每孔150 μL。细胞贴壁融合为80% ～90%后，以不同浓度(5、10、30 μmol/L)的姜黄素预处理2 h，再改用AngII(100 nmol/L)孵育1～5 d。弃去培养液，每孔中加入MTT(5 mg/mL)20 μL，继续孵育4 h吸去上清液，每孔中再加入150 μL的DMSO溶解结晶颗粒，490 nm测定各组吸光度值(OD490)。以正常对照组细胞活力100%，按细胞活力公式计算:活细胞率(%)==97.91%。

1.2.5 荧光定量PCR(real-time PCR)反应引物设计:依据GenBank提供的大鼠CTGF、PAI-1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的核酸序列，使用Desiner V 4.0进行引物设计，由南京金丝瑞生物有限公司合成。引物序列 CTGF forward:5’-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3’;reverse:5’-AGCCCGGTAGGTCTTCACACTG-3’。GAPDH引物序列用于内对照:forward，5’-GACAACTTTGGCATC GTGGA-3’;reverse，5’-ATGCAGGGATGATGTTCT GG-3’。用上述引物进行PCR，95℃，5 min 95℃，15 s 55℃，15 s 72℃，30 s 45个循环。

1.2.6 蛋白免疫印迹实验(Western-blot) 总蛋白提取:蛋白浓度测定SDS-PAGE电泳、制胶、加样和电泳、转膜，电泳结束后一抗孵育，4℃孵育过夜。二抗孵育使用TBST对PVDF膜进行清洗，每次8 min，共4次。配制相应二抗(1∶2000)，室温下孵育2 h。化学发光使用Quantity One图像分析软件，对胶片进行灰度扫描，以control为对照，其他各组灰度按照control组倍数进行统计。

1.2.7 统计学方法 姜黄素组与对照组进行方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CFs细胞的鉴定

普通形态学和免疫组化法对原代CFs细胞进行检测，CFs细胞纤维黏连蛋白染色阳性，在胞质有均匀分布的黄色丝状物质。对CFs细胞进行肌动蛋白染色，无显色现象。

2.2 不同浓度姜黄素对CFs细胞活性的影响

图1显示，为排除姜黄素可能的细胞毒性影响，我们使用 MTT法测定不同浓度姜黄素(0～100 μmol/L)对CFs细胞活性的影响。因此，在后续试验中我们选择5、10、30 μmol/L浓度姜黄素对CFs细胞进行干预。

图1 不同浓度姜黄素对CFs细胞毒性的影响

2.3 不同浓度姜黄素对CFs细胞增殖能力的影响

图2显示，使用MTT法对各组细胞增殖能力进行检查。结果提示，姜黄素可以有效地抑制AngII诱导的CFs细胞增殖作用。

图2 不同浓度姜黄素对AngII刺激的CFs细胞增殖能力影响

2.4 不同浓度姜黄素对CFs细胞CTGF、PAI-1表达的影响

图3显示，由CFs细胞通过自分泌和旁分泌途径释放的CTGF和PAI-1，可以显著增强自身及附近CFs细胞增殖和胶原分泌能力。结果提示，姜黄素可以有效抑制AngII诱导的CTGF和PAI-1表达，起到一定的抗增殖作用。

3 讨论

在原发性高血压、心肌梗塞、瓣膜性心脏病等常见心脏疾病的发展过程中，均伴有心脏纤维化的病理性改变。心脏成纤维细胞(CFs)的过度增殖和聚集、细胞外基质(ECM)的沉积是心脏纤维化的主要病理学特征。在心脏纤维化过程中，伴随激素-体液内成分浓度的改变，致纤因子分泌显著增加。AngII已被证实是强有力的致纤因子，据此本实验中我们选取AngII对CFs细胞进行刺激。CTGF通过刺激CFs增殖、增加CFs细胞I和III型胶原分泌、增强细胞迁移等方式促进心脏纤维化的发展。PAI-1已被证实，可以通过增强TGF-β/Smad通路的磷酸化，增强肾小球细胞的增殖能力［5］。在心脏纤维化的动物模型中，也发现PAI-1的表达明显升高。在肝脏、肺脏等器官的纤维化过程中，CTGF可以诱导处于原始状态的多种间质细胞向成熟状态发展［6-7］。

图3 不同浓度姜黄素对CFs细胞CTGF和PAI-1 mRAN和蛋白表达的影响

现代医学认为，姜黄素具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化和心血管保护等多种生物学效用。目前已经有试验证实，在多种常见致纤因素导致的肺部和肾脏等器官纤维化病变中，姜黄素均显示出显著的抗纤维化作用。并通过上调 cathepsins K和 cathepsins L，抑制成纤维细胞增殖和迁移能力，增加成纤维细胞凋亡比例，从而减轻博来霉素诱导的肺部纤维化。在本次实验结果中我们首次发现，姜黄素能够显著抑制AngII诱导的CFs细胞增殖能力，并具有浓度依赖性。此外，姜黄素还能减少CFs细胞CTGF和PAI-1分泌。这些结果提示，姜黄素对于可能对AngII诱导的心脏纤维化具有一定的抑制作用。

总之，姜黄素能够显著抑制AngII诱导的CFs细胞增殖能力，并具有浓度依赖性。此外，姜黄素还能够抑制AngII诱导CFs细胞CTGF和PAI-1的分泌。这些结果提示，姜黄素对于可能对AngII诱导的心脏纤维化具有一定的抑制作用。此研究对心脏纤维化的预防与治疗提供了新的观点。

［1］Abe Y，Hashimoto S，Horie T.Curcum in inhibition of inflammatory cytokine production by human peripheral blood monocytes and alveolar macrophages［J］.Pharmacol Res，1999，39(1):41-47.

［2］孙秀才，冯建章，等.姜黄素对食高脂饲料家兔血管内皮功能的保护作用［J］.岭南医学杂志，2004，10(1):60-63.

［3］Smith MR，Gangireddy SR，Narala VR，Curcumin inhibits fibrosis-related effects in IPF fibroblasts and in mice following bleomycin-induced lung injury［J］.Lung，2010 May，298(5): L616-625.

［4］WANG Yan，ZHANG Bo，LI Jianhua.Mechanisms of Renal Protection of Curcumine:Research Advanc［J］.2009，35:1673-9701.

［5］Halleux CM，Declerck PJ，Tran SL.Hormonal control of plasminogen activator inhibitor-1 gene expression and production in human adipose tissue:stimulation by glucocorticoids and inhibition by catecholamines［J］.J Clin Endocrinol Metab，1999，11，84(11):4097-4105.

［6］Riser BL，Denichilo M，Cortes P，et al.Regulation of connective tissue growth factor activity in cultured rat mesangial cells and its expressionn in experimental diabetic glomerulosclerosis［J］.J Am Soc Nephrol，2000，11(2):25-38.

［7］Ball DA，Surveyor GA，Diehl JR，et al.Characterization of 16，20kilo-Dalton(kDa)connective tissue growth factors(CTGF)and demonstration of proteolytic activity for 38 kDa CTGF in pig uterine luminal flushings［J］.Biol Reprod，1998，59(7):828-836.

Influence of curcumin on proliferation of fibroblasts into heart

YANG Hui-Yu
(Clinical Medical College，Xi’an Medical University，Xi'an 710021，China)

objective:Explore curcumin proliferate and CTGF，PAI-1 overexpression in AngII-induced effects on cardiac fibroblasts.Explore the relationship between curcumin and the proliferation of cardiac fibroblasts.Method:The primary cultured cardiac fibroblasts，respectively by inverted microscope and immunohistochemical method for primary cardiac fibroblasts were monitored.Determined by MTT method is used to test different concentrations of curcumin(0～100 mu mol/L)effect on the activity of cardiac fibroblasts.The effect of different concentration of Cur(0～100 μmol/L)on the cell proliferation ability of cardiac fibroblasts was measured by MTT assay.The levels of mRNA and protein of CTGF，PAI-1，were measured by real-time PCR and western-blotting.Result:Curcumin exhibits no cellular toxicity on cardiac fibroblasts at the concentration between 0～60 μmol/L.In our study，we chose the concentration of 5，10，and 30 μmol/ L to treat the cell to observe whether curcumin can inhibit AngII-induced over-proliferation and overexpression of CTGF and PAI-1 in cardiac fibroblasts.Conclusion:Curcumin inhibits AngII-induced cardiac fibrosis by suppressing over proliferation and the overexpression of CTGF and PAI-1 in AngII-stimulated cardiac fibroblasts.

Curcumin;Angiotensin II;Cardiac fibroblast;Fibrosis

R543.23

:B

:1006-3250(2015)07-0869-03

2015-04-19

杨蕙宇(1984-)女，讲师，医学硕士，从事心血管内科疾病的教学与研究。