冬胃颗粒对寒邪客胃型胃溃疡大鼠血清EGF、6-keto-PGF1a及ET-1的影响*

包永欣，朱 虹，吕冠华，贾金玲，毕殿红，石胜男，祝 宁，都 嵬，林一帆△

(1.沈阳军区总医院博士后科研工作站，沈阳 110015;2.沈阳军区总医院中医科，沈阳 110015; 3.辽宁中医药大学附属二院脾胃病科，沈阳 110031)

冬胃颗粒对寒邪客胃型胃溃疡大鼠血清EGF、6-keto-PGF1a及ET-1的影响*

包永欣1，2，朱 虹2，吕冠华3，贾金玲3，毕殿红3，石胜男3，祝 宁3，都 嵬3，林一帆2△

(1.沈阳军区总医院博士后科研工作站，沈阳 110015;2.沈阳军区总医院中医科，沈阳 110015; 3.辽宁中医药大学附属二院脾胃病科，沈阳 110031)

目的:探讨冬胃颗粒对寒邪客胃型胃溃疡大鼠血清细胞因子水平的影响。方法:采用乙酸注射法制备大鼠胃溃疡模型，采用寒冷因素刺激复制寒邪客胃型动物模型，前3 d先用0℃冰水浸泡，每次10 min，后3 d用0℃冰水灌胃，治疗组同时给予药物灌胃。观察各组大鼠的症状、体征，测定大鼠胃黏膜溃疡指数(UI)及溃疡抑制率，应用ELISA法检测血清细胞因子含量。结果:冬胃颗粒组大鼠表现与大便性状优于西药组。药物治疗可使溃疡缩小，冬胃颗粒组优于雷尼替丁组。与正常对照组比较，溃疡模型及寒性溃疡模型大鼠血清6-keto-PGF1α水平降低，ET-1水平增高;与寒性溃疡组比较，治疗组可明显升高6-keto-PGF1α及EGF水平，降低ET-1水平，中药治疗组6-keto-PGF1α及EGF水平高于西药治疗组，ET-1水平低于西药治疗组。结论:寒性刺激可增加胃溃疡大鼠胃黏膜损害，冬胃颗粒通过调整攻击因子与保护因素平衡起到保护作用。

寒邪客胃;胃溃疡;大鼠模型;冬胃颗粒

中医认为寒邪是重要的致病因素之一。寒冷刺激可使神经系统兴奋性升高，使胃黏膜血管收缩，引起缺血缺氧和抵抗力下降，从而引起溃疡。［1］300现代医学认为，胃溃疡的发生主要是由于胃黏膜损害因素与保护因素间的动态平衡失调所致。本研究通过模拟寒邪客胃型胃溃疡大鼠模型，观察血清表皮生长因子(EGF)、前列环素(PGI2)及内皮素(ET-1)的变化，并进一步探讨中药冬胃颗粒的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，平均体质量(200±20)g，由辽宁省中医药研究院实验动物中心提供(质量合格证编号 SCXK〔辽〕2010-0001)。

1.1.2 药物 冬胃颗粒由高良姜、香附、海螵蛸、党参、炒白术、红花、炙甘草组成，药味比例3∶2∶4∶3∶3∶3∶2，10 g/袋，由沈阳军区总医院制剂室提供。生理盐水按人与大鼠体表面积比例制成0.27 g/mL的溶液。

盐酸雷尼替丁片由石药集团中诺药业(石家庄)有限公司生产(国药准字H19994029)，0.15 g/片。用生理盐水按人与大鼠体表面积比例制成2.7 g/mL的溶液。

1.1.3 仪器与试剂 6-酮前列腺素 F2a(6-keto-PGF2a)、表皮生长因子(EGF)及内皮素-1(ET-1)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒由方远达(北京)国际生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物模型 应用冰乙酸浆膜下注射法制备大鼠胃溃疡模型［2］，造模前禁食不禁水24 h，20%乌拉坦溶液4 ml·kg-1腹腔麻醉后，将大鼠仰卧位固定、开腹，在胃窦前壁胃壁肌层与浆膜层之间注入100%冰乙酸0.03 ml，然后覆盖网膜，缝合腹膜、腹壁各层组织和皮肤。

1.2.2 分组及处置 50只大鼠分为5组，即正常对照组、溃疡模型组、寒性溃疡组、西药治疗组、中药治疗组。先按体质量随机分出10只作为正常组，其余4组造模2 d后再按体质量随机分组。寒性溃疡组与治疗组采用寒冷因素刺激，用0℃冰水浸泡大鼠10 min，水深2 cm共3 d。然后用0℃冰水1 ml/100 g大鼠灌胃，每日1次3 d，共6 d。中药治疗组及西药治疗组分别给予药物溶液1ml/100 g灌胃，每日1次;正常对照组、溃疡模型组应用生理盐水1 ml/100 g大鼠灌胃，前3 d每日1次，后3 d每日2次;寒性溃疡组给予生理盐水1 ml/100 g大鼠灌胃，每日1次，灌胃时间间隔4 h以上。

1.2.3 标本采集与处理 末次处置结束后，大鼠禁食不禁水24 h后麻醉，于腹主动脉采血4 ml，在室温下静置2 h后离心(2500 r·min-1，10 min)，取血清分成3份，-20℃保存备用。

1.2.4 观察指标与检测方法 ①溃疡指数(UI)测定:采用游标卡尺(精确度0.02 mm)测量溃疡面的最大长径和垂直于最大长径的最大宽径，以二者的乘积作为溃疡指数;②溃疡抑制率按下述公式计算:溃疡抑制率=(模型组平均溃疡指数-实验组平均溃疡指数)/模型组平均溃疡指数 × 100%;③血清EGF、6-keto-PGF1α及ET-1含量测定:采用ELISA法按试剂盒说明书步骤操作。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件进行统计分析，试验数据以均数±标准差(±s)表示，各组数据之间比较应用方差分析。

2 结果

2.1 大鼠一般状态变化

正常组大鼠精神良好，进食正常，被毛光泽，反应灵活，大便正常，体质量逐日递增。溃疡模型组大鼠造模后前2 d倦怠、懒动、食少、体质量明显降低。2 d后进食逐渐正常，反应灵活，大便基本正常。寒性溃疡组大鼠造模后前2 d倦怠、懒动、食少、大便或干或软、体质量明显降低。2 d后进食稍增加，倦怠，蜷缩聚堆，毛发疏松粗糙，晦暗无光泽，大鼠稀溏，体质量增加缓慢。治疗组大鼠造模前2 d倦怠、懒动、食少、大便或干或软，体质量明显降低。2 d后进食增加，反应较寒性溃疡组灵活，大便或干或溏，其中冬胃颗粒治疗组大便性状优于西药治疗组。

2.2 溃疡指数及溃疡抑制率比较

表1 各组大鼠溃疡指数及溃疡抑制率比较(±s)

表1 各组大鼠溃疡指数及溃疡抑制率比较(±s)

注:与溃疡模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与寒性溃疡组比较:*P＜0.01;与西药治疗组比较:＊＊P＜0.05

组 别 大鼠(n)剂量(g/kg·d)溃疡指数(mm2)溃疡抑制率(%)溃疡模型组 10 — 9.52±2.75—54.22寒性溃疡组 10 — 10.72±2.97 —西药治疗组 10 27.00 7.10±2.02△＊ 45.40中药治疗组 10 2.70 4.78±2.09△△＊＊

2.3 血清6-keto-PGF1α、EGF、ET-1含量变化

表2 各组血清6-keto-PGF1α、EGF、ET-1含量变化比较(ug·L-1，±s)

注:与正常对照组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与溃疡模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与寒性溃疡组比较:□P＜0.05，□□P＜0.01;与西药治疗组比较:◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

组 别 大鼠(n) 剂量(g/kg.d) 6-keto-PGF1αEGF ET-1正常对照组 10 —31.69±10.29 2057.78±504.82 68.03±16.52溃疡模型组 10 — 20.87± 7.33△△ 2145.06±585.95 117.31±31.27△△寒性溃疡组 10 — 12.34± 5.11△△＊ 1922.28±401.03 126.91±26.99△△西药治疗组 10 27.00 22.36± 8.82△□ 2453.92±416.83□ 95.23±21.02△△＊□□中药治疗组 10 2.70 33.79±10.22＊＊□□◇◇ 2976.23±580.28△△＊＊□□◇ 73.60±18.82△△＊＊□□◇

3 讨论

随着人们生活水平的提高，空调和冰镇食物的普及，寒邪致病也逐渐打破了季节和地域的限制。机体受到寒冷等应激刺激后，交感神经系统兴奋性升高，血管收缩引起黏膜缺血缺氧，抵抗力下降，副交感神经、垂体、肾上腺系统兴奋性升高，引起胃酸、胃蛋白酶和胃泌素等攻击因子增加，从而引起溃疡［3］。内皮素-1(ET-1)是从猪主动脉内皮细胞中分离的一种活性多肽，含21个氨基酸残基，具有强烈、持久的缩血管和促血管平滑肌增殖的作用。ET-1的这种缩血管作用，导致胃黏膜血流量下降，表现为很强的致溃疡性［4］。表皮生长因子(EGF)是参与黏膜修复的重要细胞因子，是细胞增殖和分化中起重要作用的分子［5］，具有抑制胃酸分泌、增加胃黏膜血流量、增加黏膜细胞的DNA、RNA及蛋白质的合成、促进胃黏膜上皮细胞增殖的作用。而前列环素(PGI2)能通过抑制胃酸分泌、刺激组织修复过程、增加胃黏膜血流量，从而保护胃黏膜的完整性并加速溃疡的愈合［6］。

沈阳军区总医院中医科根据北方地区人群易感受寒邪导致胃脘疼痛发生或加重，在古方良附丸的基础上加味制成院内制剂“冬胃颗粒”，治疗寒性胃痛或急慢性胃炎、消化性溃疡遇寒加重的患者，取得了较好的临床疗效［7］。方中高良姜为君，味辛大热，温胃祛寒，行气止痛。《别录》记载“主暴冷、胃中冷逆、霍乱腹痛”;香附为臣，行气解郁，调经止痛，主治肝胃不和，气郁不舒;两药相配，一散寒凝，一行气滞，共奏行气散寒、温中止痛之功;红花辛温，活血化瘀、祛瘀止痛;炒白术甘苦温燥，燥湿健脾，健运中州，培补后天之本，气旺而阳亦复，共为臣药;海螵蛸含有碳酸钙，具有抗胃酸作用，制酸止痛，收敛止血，用为佐药;甘草性温补益脾气、调和诸药兼为佐使，全方配合共奏行气散寒、祛瘀止痛、温中健脾之功效。现代药理研究显示，香附、高良姜皆有镇痛作用，而高良姜更有抗溃疡、抗炎、抗菌等作用。高良姜的抗炎镇痛作用可能与抑制前列腺素的合成释放有关［8］。

为进一步研究冬胃颗粒对寒性胃脘痛的保护作用机制，参照黎敬波等采用醋酸注射法造成大鼠胃溃疡并施加寒性病因刺激，造成实寒证胃溃疡大鼠模型方法［9］，对乙酸性胃溃疡大鼠应用寒冷刺激复制寒邪客胃型胃溃疡大鼠模型，结果寒性溃疡组大鼠比单纯溃疡组大鼠一般状态差，体质量增加缓慢。溃疡组与寒性溃疡组光镜下病理提示，黏膜脱落形成明显溃疡，炎性细胞浸润，黏膜腺体消失，与机体表现相一致。寒性刺激可加重大鼠溃疡黏膜损害，药物治疗可使溃疡缩小，冬胃颗粒治疗组优于雷尼替丁组。与正常对照组比较，溃疡模型及寒性溃疡模型大鼠血清保护因子6-keto-PGF1α水平降低，损害因子ET-1水平增高;与寒性溃疡组比较，治疗组可明显升高6-keto-PGF1α及EGF水平，降低ET-1水平，中药治疗组6-keto-PGF1α及EGF水平高于西药治疗组，ET-1水平低于西药治疗组。冬胃颗粒治疗组能明显提高血清6-keto-PGF1α含量，接近于正常对照组水平。溃疡模型组与寒性溃疡组EGF水平与正常对照组比较差异无统计学意义，但中西药治疗组血清EGF含量与正常对照组、溃疡模型组及寒性溃疡组比较均有不同程度的升高。寒冷刺激虽然不能影响EGF水平，但通过温中散寒止痛中药冬胃颗粒的治疗，其EGF水平却明显优于西药治疗组。结果证明，寒性刺激可增加胃溃疡大鼠胃黏膜损害，冬胃颗粒通过调整攻击因子与保护因素平衡起到较好的保护作用。

［1］吴卓霖，林一帆，赵明宏，等.冬胃颗粒对寒凝血瘀型消化性溃疡大鼠保护作用的观察［J］.沈阳部队医药，2011，24(5): 296-298.

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Effect of Dongwei Granule on Serum ET-1，6-keto-PGF1a and EGF in Gastric Ulcer Rats with Cold Pathogen

BAO Yong-xin1，ZHU Hong2，LV Guan-hua3，JIA Jin-ling3，BI Dian-hong3，SHI Sheng-nan3，ZHU Ning3，DU Wei3，LIN Yi-fan2△
(1.Post-Doctoral Research Center，the General Hospital of Shengyang Military Region，Shenyang 110016，China; 2.Department of TCM，the General Hospital of Shengyang Military Region，Shenyang 110016，China; 3.Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM，Shenyang 110034，China)

Objective:To study the influence of Dongwei Granule on the levels of cytokines in serum of Acetic Acidinduced Gastric Ulcer in Rats with cold stimulation.Methods:The rat model of gastric ulcer was constructed by injection of acetic acid.The rats were stimulated by cold，filled the stomach with 0℃ ice water 3 days after soaked with 0℃ ice water 3 days.The rats of treatment groups were filled the stomach with Chinese or western medicine.The changes of rat superficial signs and symptoms and ulcer sizes were recorded to calculate the ulcer index(UI)and ulcer inhibitory rate.And the levels of EGF，6-keto-PGF1αand ET-1 were detected by ELISA.Results:The signs and symptoms of treatment groups were better than ulcer model group.The treatment of Ranitidine and Dongwei granule can reduce the ulcer area of rat model.Compared with gastric ulcer model of cold stimulation group，the UI of treatment groups was reduced significantly.The ulcer inhibitory rate of Dongwei granule treatment group was better than Ranitidine treatment group.The levels of 6-keto-PGF1αof model of gastric ulcer group and gastric ulcer model of cold stimulation group were decreased significantly，and the levels of ET-1 were increased significantly compared with normal control group.The levels of 6-keto-PGF1αof gastric ulcer model of cold stimulation group were lower than model of gastric ulcer group.Compared with gastric ulcer model of cold stimulation group，the levels of 6-keto-PGF1αand EGF in serum of treating groups were increased significantly，the levels of ET-1 Were decreased significantly，the levels of 6-keto-PGF1αand EGF of Dongwei granule treatment group were higher than Ranitidine treatment group，and the levels of ET-1 were lower.Conclusion:Cold stimulation can aggravate the damage of gastric mucosa of gastric ulcer rats，and Dongwei granule can alleviate the damage through re-establishing the balance of attack factors and protective factors.

Cold Stimulation;gastric ulcer;rat model;Dongwei granule

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0809-03

2015-04-18

军队“十二五”中医药专项重点课题基金(10ZYZ102)-东北战区军人消化性溃疡中医证候分布规律与发病相关因素的调查及冬胃颗粒防治的研究

包永欣，女，在站博士后，从事中医药消化系统疾病的临床与实验研究。

△通讯作者:林一帆，E-mail:13309888130@163.com。