固定配方加引经药牛膝对防治兔股骨头坏死的作用机制研究

商 震，程建姝

(山东省济南市第三人民医院，济南 250101)

固定配方加引经药牛膝对防治兔股骨头坏死的作用机制研究

商 震，程建姝

(山东省济南市第三人民医院，济南 250101)

目的:探讨中药固定配方补气生骨方加引经药牛膝对兔股骨头坏死的修复作用并对其机制进行初步研究。方法:通过大肠杆菌内毒素联合氢化泼尼松龙制作激素性兔股骨头坏死模型，用补气生骨方并分别加引经药牛膝和独活治疗股骨头坏死，观察血管分布、组织病理学变化，检测血清中IGF-1含量及血管VEGF的表达。结果:2周、4周、8周时牛膝组血管面积与模型组比较增加，且差异有统计学意义，均大于固定配方组与独活组。病理学观察该方加引经药牛膝可使骨小梁间隙降低，厚度和体积增加，空骨陷窝率下降，与模型组比较差异有统计学意义，均小于固定配方组和独活组，并可明显提高血清中IGF-1含量以及VEGF的表达水平。结论:补气生骨方加引经药牛膝可通过提高血清中IGF-1含量以及VEGF的表达水平来促进股骨头坏死的修复，其中引经药对于药物作用的发挥起到了重要引导作用。

引经药;牛膝;股骨头坏死

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是由多种因素引发的血液运输障碍(缺血性坏死)而导致骨内部组织坏死的一种病症，是一种常见、多发、难治的骨科临床病［1-2］。目前该病可采用中西医治疗方法，西医以手术治疗为主，但其临床治疗效果并不满意［3］。中药在该病的早中期治疗中起到一定的延缓作用，并具有一定的优势。中药治疗主要基于活血化瘀论、壮骨补肾论［4］。常用的中药配方有补肾活血汤、生骨再造汤、活骨生骨方、补气生骨方等［5-7］，许多学者主张两者并重。现代医学对该病进行了细胞因子调控、分子机制等方面的研究，并取得一定成果。而在我国传统中医药方面多侧重于基础理论、中医辨证治疗，其深度和广度还有待进一步提高。

本研究通过低剂量脂多糖(LPS)联合氢化泼尼松龙制作激素性兔股骨头坏死模型，采用固定配方补气生骨方并加引经药牛膝治疗兔股骨头坏死，观察血管分布、组织病理学变化，通过检测血清中胰岛素生长因子-1(insulin growth factor，IGF-1)含量及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，对其作用机制进行分子水平的研究。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级健康成年雄性新西兰大白兔60只，体质量(2.5±0.3)kg，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心提供，单笼饲养。

1.2 试剂与仪器

大肠杆菌内毒素(美国，sigma);醋酸氢化泼尼松龙(山东，辰欣药业);青霉素钠(北京，Solarbio); SABC免疫组化试剂盒、IGF-1酶联免疫试剂盒(南京，建成);VEGF单克隆抗体(美国，Millipore)。生物组织包埋机(KD-BM，浙江科迪仪器)、切片机(RM 2016，上海徕卡)、医学图像分析系统(CT2-BI-2000，中国北航)。

1.3 方法

1.3.1 动物造模与分组 48只新西兰大白兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素(5 ug/kg)，24 h后重复给药，同时肌注醋酸氢化泼尼松龙(30 mg/kg)连续4 d，每天注射20万单位的青霉素钠以防感染。通过CT扫描筛选出造模成功的动物，并按随机数字表法分为模型组、固定配方组、牛膝组、独活组4组，同时另12只作为正常对照组。固定配方组每天灌胃补气生骨方水煎剂，牛膝组灌胃补气生骨方水煎剂加牛膝(0.75 g·kg-1·d-1)，独活组灌胃补气生骨方水煎药加独活(0.75 g·kg-1·d-1)，模型组和正常组给予相同剂量的生理盐水。

1.3.2 墨汁灌注血管观察 分别于给药2周、4周、8周时用3%戊巴比妥钠麻醉动物(30 mg/ kg)，于腹部切口，剥离暴露腹主动脉和下腔静脉，插上导管立即注入肝素，然后加压注入生理盐水，直至下腔静脉流出的液体澄清，最后注入墨汁直至兔双下肢发黑。取双侧股骨头剔除冗余组织，甲醛固定，盐酸甲酸脱钙，梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋、透明、切片，于光镜下观察血管分布及形态变化，通过医学图像分析系统计算血管面积。

1.3.3 组织病理学观察 分别于给药2周、4周、8周时处死动物取双侧股骨头，剔除冗余组织，甲醛固定，盐酸甲酸脱钙，梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋、透明、切片，HE染色观察其病理学变化。高倍镜下选取100个骨陷窝计算空骨陷窝率。

1.3.4 血清中IGF-1的测定 于2周、4周、8周时空腹状态下兔耳后中央动脉取血，离心取上清，-20℃保存。按IGF-1酶联免疫试剂盒所述方法测定各组不同时间点血清中IGF-1的含量，根据标准品与吸光值作标准曲线，求得IGF-1浓度。

1.3.5 免疫组化VEGF染色 按试剂盒说明将各组2周、4周、8周时的石蜡切片进行脱蜡，过氧化氢洗涤，抗原热修复，PBS清洗，山羊血清封闭液封闭，依次加入一抗、二抗、SABC，最后DAB显色剂显色。通过医学图像分析系统对VEGF的表达进行分析，选取多个视野求得平均值，对表达阳性细胞计数。

1.3.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 墨汁灌注血管观察结果

表1显示，光镜下观察墨汁灌注切片可见，正常组血管被均匀染成黑色并呈网状。模型组血管稀疏、紊乱，部分出现血栓现象，其面积小于正常组，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。给药后3组给药组血管面积均有所增加;4周、8周时牛膝组血管面积与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);独活组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，且4周、8周时牛膝组血管面积均大于固定配方组与独活组。

表1 各组髓腔中血管面积的比较(±s，μm2)

表1 各组髓腔中血管面积的比较(±s，μm2)

注:与正常组比较:aaP＜0.01;与模型组比较:bP＜0.05，bbP＜0.01

组 别 例数 2周 4周 8周4 255.1±12.3 268.4±34.5 277.8±21.6模 型 组 4 164.2±13.9aa145.9±21.8aa 144.6±18.9aa固定配方组 4 184.6±9.08 199.5±33.0b 203.2±30.1bb牛 膝 组 4 213.4±21.3b 235.8±14.7bb 253.6±24.5bb独 活 组 4 221.6±18.7b 230.7±22.2b 241.9±19.6正常组b

2.2 组织病理学观察结果

图1表2显示，造模成功的股骨头组织切片可见，骨小梁稀疏，出现萎缩和连续性中断现象;骨髓坏死，造血组织明显减少，髓腔脂肪变性、纤维化;空骨陷窝率增加;破骨细胞增多，骨细胞核皱缩。与模型组比较，给予补气生骨方治疗后骨小梁间隙降低，厚度和体积有所增加，空骨陷窝率下降，在2周、4周、8周时与模型组比较差异有统计学意义;牛膝组与独活组空骨陷窝率与模型组比较差异有统计学意义，且牛膝组均大于固定配方组和独活组。

表2 各组兔血清中IGF-1含量比较(±s，ng/ml)

表2 各组兔血清中IGF-1含量比较(±s，ng/ml)

注:与正常组比较:aaP＜0.01;与模型组比较:bP＜0.05，bbP＜0.01

组 别例数 2周 4周 8周4 22.12±0.51 19.62±3.45 20.57±2.16模 型 组 4 12.29±2.12aa 14.52±0.83aa 13.46±1.46a固定配方组 4 14.87±3.03 15.98±0.84 18.45±2.18bb牛 膝 组 4 15.74±2.19b 16.25±2.34b 19.43±1.47bb独 活 组 4 16.02±2.17b 16.66±1.62b 18.51±0.54正 常 组b

2.3 血清中IGF-1的变化

与正常组比较，3个时间点模型组血清中IGF-1含量均下降，2组间比较差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，3个实验组IGF-1含量均上升，在8周时，固定配方组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);在2周、4周时，牛膝组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，在8周时差异有统计学意义(P＜0.01);在2周、4周、8周时独活组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。上述结果显示，给药组可以提高血清中IGF-1含量，其中牛膝组作用最明显，独活组为其次。

图1 实验4周时各组股骨头组织病理切片观察(100×)

图2 各组股骨头空骨陷窝率比较

2.4 VEGF免疫组化结果

光镜下可见，各组免疫组化切片成骨细胞、软骨细胞、骨细胞、造血细胞中均有VEGF的表达。与正常组比较，各个时间点模型组VEGF阳性细胞表达数目均减少，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，3组给药组阳性细胞表达数目均增加，在2周时与模型组比较，牛膝组差异有统计学意义(P＜0.05)，在4周、8周时比较差异有统计学意义(P＜0.01);固定配方组、独活组在4周、8周时与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，总体比较结果为正常组＞牛膝组＞独活组＞固定配方组＞模型组。

表3 各组免疫组化VEGF表达阳性细胞数目比较(±s)

表3 各组免疫组化VEGF表达阳性细胞数目比较(±s)

注:与正常组比较:aaP＜0.01;与模型组比较:bP＜0.05，bbP＜0.01

组 别 例数 2周 4周 8周4 201±12.0 189±22 221±16模 型 组 4 122±11.0aa 103±34aa 117±12aa固定配方组 4 132± 8.0 145±42b 168±29b牛 膝 组 4 152±21.3b 178±14bb 209±25bb独 活 组 4 144±36.0 166±13b 189±19正常组b

3 讨论

补气生骨方(黄芪、白芷、穿山甲、何首乌)中的黄芪甘温可益气生血为主药;白芷性温可散风祛湿、通窍止痛;穿山甲咸寒入肝经可解痉挛、止疼痛、祛风通络;何首乌甘苦可补肝肾、强筋骨、益精血，诸药结合使用，具有补气养血、通络除痹的功效［7］。引经药具有一定的向导作用［8］，牛膝所含的化学活性物质多，药理作用较多，作为引经药具有活血下行的功效，可补肝肾、强筋骨，改善缺血状态，促进骨组织修复［9］。股骨头坏死是一种缺血性坏死，其病变与血管及血液运输密切相关，而VEGF是目前所知惟一特异性作用于血管内皮细胞诱导血管新生的生长因子［10-11］，同时VEGF可诱导成骨细胞增殖，促进骨修复［12-13］。有研究证明，血清中的IGF-1作用于骨细胞内的内皮生长因子，从而促进其增殖，并加快新生血管的生长，对软骨细胞的分裂增殖与功能代谢也有影响［14-15］。

为探讨中药配方及引经药对股骨头坏死的作用及机制，本研究以单独补气生骨方中药及引经药独活为对照，进行组织病理学观察及一些指标测定。结果表明，补气生骨方对早中期股骨头坏死具有一定的预防及缓解作用，加入引经药牛膝和独活后其作用增强，表现为骨小梁间隙降低，厚度和体积有所增加，骨细胞、软骨细胞和血管数量等增多。通过测定血清中IGF-1含量以及VEGF的表达水平发现，补气生骨方加引经药牛膝可明显提高 IGF-1及VEGF水平，从而刺激血管新生，促进骨细胞增殖和分化，对股骨头坏死起到一定的修复作用。牛膝引导各中药成分充分发挥作用，与引经药独活相比，其引导作用更强。

综上所述，补气生骨方加引经药牛膝可通过提高血清中IGF-1含量以及VEGF的表达水平来促进股骨头的坏死，其中引经药牛膝对于药物作用的发挥起到了重要的引导作用。

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Effects and Mechanism Research on the Fixed Recipe Plus Channel Ushering Drug of Achyranthes Bidentata on the Prevention and Treatment of Rabbit Femoral Osteonecrosis

SHANG Zhen，CHENG Jian-shu
(No.People's Hospital Jinan City，Shandong Province，Jinan 250101，China)

Objective:To study the effect and mechanisms of fixed formula with channel ushering drug-achyranthes on the osteonecrosis of the femoral head.Methods:The hormone-induced osteonecrosis of femoral head model was made by Escherichia coli endotoxin and hydrogenated prednisolone in rabbits，and they were treated with replenishing Qi and producing bone formula combining with different channel ushering drugs-achyranthes and pubescent angelica.The vascular distribution and histopathological changes were observed，the level of IGF-1 in serum and the expression of VEGF were detected.Results:The vascular area of achyranthes group was increased and was significantly different when compared with model group at the 2nd，4thand 8thweeks.It was also higher than the fixed formula group and pubescent angelica group.Histopathological observations showed that the mean space of trabecular bone reduced and thickness and volume increased.The ratio of empty lacuna declined significantly when compared with model group，and was smaller than fixed formula group and pubescent angelica group.The level of IGF-1 in serum and the expression of VEGF were increased significantly.Conclusion:The fixed formula with achyranthes can promote the healing of osteonecrosis of the femoral head by increasing the levels of IGF-1 in serum and the expression of VEGF，in which the channel ushering drug achyranthes plays an important guiding role.

Channel ushering drug;Achyranthes;Osteonecrosis of the femoral head

R683.41

:B

:1006-3250(2015)07-0803-03

2015-05-19

商 震(1974-)，男，主治医师，医学硕士，从事骨外科的临床与研究。