鹿茸中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达的影响*

王 剑，郑洪新，张锦萍，刘 研，刘剑辉，宋光熠，刘瑞辉

(1.辽宁医药职业学院，沈阳 110101;2.辽宁省基础医学研究所，沈阳 110101; 3.辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847)

鹿茸中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达的影响*

王 剑1，2，郑洪新3△，张锦萍1，刘 研1，刘剑辉1，宋光熠1，刘瑞辉1

(1.辽宁医药职业学院，沈阳 110101;2.辽宁省基础医学研究所，沈阳 110101; 3.辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847)

目的:观察去卵巢骨质疏松症大鼠肾组织 Msx2 mRNA及蛋白表达，探讨绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)的发病机制以及鹿茸中药复方的疗效机理。方法:去卵巢复制骨质疏松症大鼠模型，实验设正常组、模型组、假手术组、鹿茸中药复方组、钙尔奇D组、骨疏康组，灌胃给药12周。应用双能X线骨密度仪检测骨密度，实时定量RT-PCR及Western Blot检测Msx2 mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较，模型组股骨骨密度明显降低、肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达明显降低;与模型组比较，鹿茸中药复方组、骨疏康组股骨骨密度明显升高;鹿茸中药复方组、钙尔奇D组、骨疏康组肾组织Msx2 mRNA表达明显上调;鹿茸中药复方组肾组织Msx2蛋白表达明显上调;与钙尔奇D组、骨疏康组比较，鹿茸中药复方组肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达均明显升高。结论:PMOP的发病机制之一可能是肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达降低，鹿茸中药复方可能通过上调肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达，有效防治PMOP，其作用优于钙尔奇D和骨疏康。

绝经后骨质疏松症;鹿茸中药复方;Msx2

绝经后骨质疏松症 (Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)是原发性骨质疏松症之一，严重危害老年人的健康，随着社会老龄化的增速，PMOP患病人群日益庞大。调查表明，目前约占我国人口7%的骨质疏松症患者中半数为50岁以上的妇女［1］，故深入探讨PMOP的发病机制和防治方法具有重要的现实意义。本研究依据中医“肾主骨”理论研制具有补肾填精、益髓壮骨功效的鹿茸中药复方，通过观察肾组织Msx2(muscle segment homeobox gene 2)mRNA及蛋白表达变化，探讨鹿茸中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠的疗效与机理，为中医药防治PMOP提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级Wistar雌性大鼠100只，4～5月龄，体质量(275±25)g，购自辽宁长生生物技术有限公司(合格证号0004179)。

1.2 药品

鹿茸中药复方由鹿茸、淫羊藿、牡蛎组成，对照药钙尔奇D(Wyeth)、骨疏康颗粒(辽宁康辰药业有限公司)。

1.3 主要仪器

XR-36型双能X线骨密度仪(NORLAND)、ABI 7500型定量 PCR仪、PowerPac200电泳仪(BIORAD)等。

TRIZOL(康为世纪)、实时定量RT-PCR试剂盒(TaKaRa)、羊抗Msx2多克隆抗体(santa cruz)、碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG(北京中山生物公司)等。

2 方法

2.1 分组

预实验用7只，余者按随机数字表法分为6组，正常组(A)12只，模型组(B)12只，假手术组(C)12只，鹿茸中药复方组(D)20只，钙尔奇D组(E)18只，骨疏康组(F)19只。

2.2 造模

正常组除外其余麻醉，2%戊巴比妥钠腹腔注射(35 mg/kg)，然后腹部切口行双侧卵巢摘除术，其中假手术组只切切口不摘除卵巢。

2.3 给药

术后7 d开始每日灌胃1次，连续12周。大鼠给药剂量按成人剂量的6.3倍计算，给药容积0.5 ml/100 g。A、B、C 3组均给予生理盐水，D组给予鹿茸中药复方1.139 g·kg-1·d-1，E组给予钙尔奇D 0.126 g钙·kg-1·d-1，F组给予骨疏康颗粒2.1 g ·kg-1·d-1。

答：勇敢些！不要让自己被国际趋势和要求控制．明确自己的研究问题，并深入思考进行研究．当然，对于年轻研究者而言，了解和借鉴一些国际已有的数学教育研究是必要的．但是回顾我们领域内目前发表的研究中高质量的、影响深远的文章，无一不是得益于研究者“勇敢”的探究．

2.4 指标检测

2.4.1 骨密度(BMD) 取右后肢全股骨剔除附着筋肉，生理盐水润湿医用纱布后包裹骨外，纱布外裹锡纸，-20℃冰箱冻存待测。应用XR-36型双能X线骨密度仪对大鼠离体股骨骨密度进行检测，应用仪器附带软件进行数据分析。

2.4.2 Msx2 mRNA表达 取左肾皮髓交界处一块约100 mg的肾组织，放入预装1ml Trizol的EP管内，-70℃冰箱冻存待测。按Trizol试剂盒说明书抽提样品总RNA。测抽提物260 nm与280 nm的吸光度，OD 260/OD 280约2.0，提示为RNA纯品。应用ABI 7500型定量PCR仪进行反转录和实时定量PCR扩增，引物由北京华大基因公司合成。Msx2上游引物:5'-GGG CAC AGA GGA GAT TG-3'，下游引物:5'-GGG AAG AGG TGG ACA GG-3'，扩增产物长度294 bp。由仪器自带软件收集扩增数据并计算Ct值，以GAPDH(上游引物:5'-CGT ATC GGA CGC CTG GTT-3'，下游引物:5'-CGT GGG TAG AGT CAT ACT GGA AC-3'，扩增产物长度124 bp)为内参校准，采用2-△△Ct(Livak)方法对Msx2的mRNA表达进行相对定量。

2.4.3 Msx2蛋白表达 取左肾皮髓交界处一块约100 mg的肾组织放入空白EP管内，-70℃冰箱冻存，待做Western Blot。细胞裂解法提取样品总蛋白，Lowry法定量，SDS-PAGE凝胶电泳、转印，羊抗Msx2多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG孵育，酶显法显色。Tanon-2500R型全自动数码凝胶成像系统成像，使用Scion Image软件分析灰度值。以GAPDH为内参校准，以Msx2条带灰度值/ GAPDH条带灰度值来表示其相对蛋白表达。

2.5 统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件进行统计分析，单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

大鼠在灌胃期间死亡5只，取材时共88只。

3.1 骨密度

表1显示，与正常组比较，模型组明显降低(P＜0.001);与模型组比较，鹿茸中药复方组、骨疏康组明显升高(P＜0.05)，钙尔奇D组虽有升高趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠离体股骨骨密度比较(±s)

表1 各组大鼠离体股骨骨密度比较(±s)

注:与正常组比较:＊＊＊P＜0.001;与模型组比较:△P＜0.05

组别 例数 股骨骨密度(g/cm2) 12 0.1375±0.0063模 型 组 12 0.1259±0.0060＊＊＊假 手 术 组 11 0.1331±0.0109△鹿 茸 中 药 复 方 组 19 0.1327±0.0095△钙 尔 奇 D 组 17 0.1286±0.0058骨 疏 康 组 17 0.1321±0.0057正常组△

3.2 Msx2 mRNA表达

表2显示，与正常组比较，模型组明显降低(P＜0.001);与模型组比较，鹿茸中药复方组(P＜0.001)、钙尔奇 D组(P＜0.01)、骨疏康组(P＜0.01)明显上调;与钙尔奇D组、骨疏康组比较，鹿茸中药复方组明显升高(P＜0.01)。

3.3 Msx2蛋白表达

图1表3显示，与正常组比较，模型组明显降低(P＜0.001);与模型组比较，鹿茸中药复方组明显上调(P＜0.01)，钙尔奇D组、骨疏康组虽有升高趋势，但无统计学意义(P＞0.05);与钙尔奇D组、骨疏康组比较，鹿茸中药复方组明显升高(P＜0.05)。

表2 各组大鼠肾组织Msx2 mRNA表达(±s)

表2 各组大鼠肾组织Msx2 mRNA表达(±s)

注:与正常组比较:＊＊＊P＜0.001;与模型组比较:△△P＜0.01，△△△P＜0.001;与钙尔奇D组比较:★★P＜0.01;与骨疏康组比较:※※P＜0.01

组别 例数 Msx2(mRNA) 10 1.001±0.067模 型 组 10 0.326±0.043＊＊＊假 手 术 组 10 0.927±0.077△△△鹿 茸 中 药 复 方 组 10 0.776±0.035△△△★★※※钙 尔 奇 D 组 10 0.587±0.075△△骨 疏 康 组 10 0.538±0.120正常组△△

图1 肾组织Msx2、GAPDH蛋白Western Blot条带

4 讨论

PMOP指主要由绝经后雌激素水平降低引起的骨质疏松症。我国PMOP患病人数据调查不少于2000万，患病人群日益庞大，深入探讨其发病机制和防治方法具有重要的现实意义。

表3 各组大鼠肾组织Msx2蛋白表达(±s)

表3 各组大鼠肾组织Msx2蛋白表达(±s)

注:与正常组比较:＊＊＊P＜0.001;与模型组比较:△△P＜0.01，△△△P＜0.001;与钙尔奇D组比较:★P＜0.05;与骨疏康组比较:※P＜0.05

组别 例数 Msx2(蛋白) 10 0.780±0.115模型正常组10 0.435±0.048组 10 0.416±0.059＊＊＊假 手 术 组 10 0.814±0.134△△△鹿 茸 中 药 复 方 组 10 0.584±0.070△△★※钙 尔 奇 D 组 10 0.468±0.064骨 疏 康 组

中医学古籍中虽没有“骨质疏松症”这一病名的记载，但有关“骨痹”(骨重不可举、骨髓酸痛)、“骨痿”(腰脊不举)、“骨缩病”(诸骨皆枯，渐至短缩)等描述均与骨质疏松症的症状(骨痛、腰背痛最多见，驼背、变矮、骨折)比较相似，因此探讨骨质疏松症的中医病因病机可参照中医古籍对相关骨病的认识。《素问·痿论》:“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”《扁鹊心书·骨缩》:“此由肾气虚惫，肾主骨，肾水既涸，则诸骨皆枯，渐至短缩。”中医理论认为“肾藏精生髓主骨”，骨病多责之于肾。《素问·六节藏象论》:“肾者、主蛰，封藏之本，精之处也……其充在骨。”《素问·痿论》:“肾主身之骨髓。”《素问·脉要精微论》:“骨者髓之府”，都说明肾主藏精，精生髓，髓居于骨中，骨赖髓以充养。《灵枢·本神》:“精伤则骨酸痿厥”，说明肾精亏虚，生髓不足，无以养骨而发生骨质疏松等病变。《素问·上古天真论》:“女子七岁，肾气盛，齿更发长……四七筋骨坚……七七……天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”，说明女子盛年之前，肾中精气与龄俱充，生髓充盛，滋养骨骼，骨坚有力;盛年之后，肾中精气与龄俱衰，七七绝经后，精亏生髓不足，骨骼失于滋养而痿软无力即发骨质疏松。因此，PMOP的病机是肾虚精亏、髓减骨枯，防治该病可选用补肾填精、益髓壮骨法。

现代医学研究表明，肾小管对Ca2+的重吸收可以调节血钙水平，进而调节甲状旁腺激素分泌，影响破骨细胞分化及其骨吸收活性，间接调节骨吸收［2，11］。瞬时性受体电位通道5(transient receptor potential vanilloid 5，TRPV5)是介导肾小管主动重吸收Ca2+的主要蛋白，其表达下降或失活可能导致尿钙显著增多［3］。Msx基因家族的Msx2可通过对其下游一系列基因表达的级联调控作用激活TRPV5。Msx2抑制 Runx2转录［4］，Runx2上调 Osterix转录［5-6］，Osterix阻止PPARγ基因表达［7］，PPARγ上调血清糖皮质激素诱导蛋白激酶1的mRNA表达［8-9］;血清糖皮质激素诱导蛋白激酶 1激活TRPV5［8-10］，从而使肾小管对Ca2+的重吸收增加，血钙浓度升高，从而使甲状旁腺主细胞的活动降低，甲状旁腺激素的分泌下降，受其诱导的破骨细胞分化减少，受其促进的破骨细胞骨吸收活性减弱，从而减少骨吸收［11］。

Msx2在PMOP的发病机制及其中医药治疗方面的研究，笔者尚未查阅到相关文献。雌性大鼠行双侧卵巢摘除术造模是研究PMOP的经典模型［12］。本研究即采用此法建立PMOP动物模型，以肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达作为效应指标，研制具有补肾填精、益髓壮骨功效的鹿茸中药复方。君药鹿茸性温、味甘、咸，归肾、肝经，有壮肾阳、益精血、强筋骨等功效。现代研究表明，鹿茸含有多种生长因子，可刺激成骨细胞分化、增殖，促进骨的生长、修复，防治骨质疏松;臣药淫羊藿性温、味辛、甘，归肾、肝经，有补肾壮阳、强筋健骨等功效。现代研究表明，淫羊藿的有效药理成分淫羊藿苷能促进人骨髓间充质干细胞增殖，促进其成骨分化，促进成骨细胞增殖与分化，促进骨形成，抑制破骨细胞分化和功能，抑制骨吸收，防治骨质疏松;佐药牡蛎性微寒、味咸，归肾、肝经，具有补肾壮骨、滋阴潜阳的功效。现代研究表明，牡蛎中含90%以上的碳酸钙，补钙效果好，可防治骨质疏松。作为实验因素，选用西医临床治疗骨质疏松症的常用药钙尔奇D(药理作用是促进肠道吸收钙、磷和骨骼正常钙化)和中药复方治疗骨质疏松症的骨疏康颗粒(具有补肾益气、活血壮骨的功效)为对照药，探讨PMOP的发病机制以及鹿茸中药复方的疗效机理。结果显示，模型组骨密度比正常组明显降低，说明本研究成功复制了PMOP动物模型。模型组肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达比正常组明显降低，可能通过影响其下游一系列基因表达而增强骨吸收。与模型组比较，鹿茸中药复方明显上调肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达，可能通过级联调控其下游一系列基因的表达而减少骨吸收，从而使骨密度明显升高，疗效显著，胜于骨疏康颗粒;钙尔奇 D虽亦可明显上调肾组织 Msx2的mRNA表达，但对其蛋白表达和骨密度的升高均无统计学意义。因此，绝经后骨质疏松症的发病机制之一可能是肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达降低;具有补肾填精、益髓壮骨功效的鹿茸中药复方可明显上调肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达，有效防治绝经后骨质疏松症，疗效胜于钙尔奇D及骨疏康颗粒，临床可选用补肾填精、益髓壮骨法防治绝经后骨质疏松症。

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Effects of Antler Prescription on the Expression of Msx2 mRNA and Protein in Renal Tissue of Ovariectomy Osteoporosis rats

WANG Jian1，2，ZHENG Hong-xin3△，ZHANG Jin-ping1，LIU Yan1，LIU Jian-hui1，SONG Guang-yi1，LIU Rui-hui1
(1.Liaoning Vocational College of Medicine，Shenyang 110101，China;2.Liaoning Institute of Basic Medicine，Shenyang 110101，China;3.Basic Medical College，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China)

Objective:To discuss the pathogenesis of postmenopausal osteoporosis(PMOP)and the therapeutic effect and mechanism of pilose antler traditional Chinese medicine compound by Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues of ovariectomized osteoporosis rats.Methods:We established the osteoporosis rat models by ovariotomy.We divided all the rats into normal group，model group，sham-operated group，pilose antler traditional Chinese medicine compound group，GAIERQI D group and GUSHUKANG group.After 12 weeks of administrating by gavage，we used dual energy X-ray absorptiometry to detect bone mineral density，Real-Time Quantitative RT-PCR to detect Msx2 mRNA expression and Western Blot to detect Msx2 protein expression.Results:Compared with normal group，femur bone mineral density of model group decreased significantly，Msx2 mRNA and protein expression decreased significantly in kidney tissues.Compared with model group，femur bone mineral density of pilose antler traditional Chinese medicine compound group and GUSHUKANG group increased significantly;Msx2 mRNA expression in kidney tissues of pilose antler traditional Chinese medicine compound group，GAIERQI D group and GUSHUKANG group up-regulated significantly;Msx2 protein expression in kidney tissues of pilose antler traditional Chinese medicine compound group up-regulated significantly.Compared with GAIERQI D group and GUSHUKANG group，Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues of pilose antler traditional Chinese medicine compound group both increased significantly.Conclusions:Maybe it is one aspect of the pathogenesis of PMOP that Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues decreases;Pilose antler traditional Chinese medicine compound has better effects of up-regulating Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues to prevent and treat PMOP than GAIERQI D and GUSHUKANG.

postmenopausal osteoporosis(PMOP);pilose antler traditional Chinese medicine compound;muscle segment homeobox gene 2(Msx2)

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0800-03

2015-04-16

辽宁省教育厅科学研究一般项目 (L2011247)-补肾益髓法对绝经后骨质疏松症Runx2相关基因表达的级联调控作用

王 剑(1978-)，女，辽宁沈阳人，副教授，医学博士，从事中医药与分子生物学相关研究。

△通讯作者:郑洪新，教授，博士研究生导师，从事中医病因病机理论研究，E-mail:zhenghx2002@126.com。