叶酸偶联白蛋白纳米粒的应用研究进展

赵洁，夏亚丹，刘艳艳(菏泽市牡丹人民医院，山东菏泽74000;泰安市中心医院;菏泽医学专科学校)

叶酸偶联白蛋白纳米粒的应用研究进展

赵洁1，夏亚丹2，刘艳艳3
(1菏泽市牡丹人民医院，山东菏泽274000;2泰安市中心医院;3菏泽医学专科学校)

摘要:叶酸偶联白蛋白纳米粒具有主动靶向性和靶向范围广等独特优点，应用前景广阔。笔者收集整理了叶酸偶联白蛋白纳米粒的相关国内外文献，现对其作为靶向药物载体的制备方法、靶向性、载药方式及其应用作一综述。

关键词:叶酸;白蛋白纳米粒;叶酸受体;药物载体;肿瘤;主动靶向性

传统的抗肿瘤药物缺乏靶向性，不良反应多［1］。近年来肿瘤的靶向给药体系为研究热点［2］。自2005年美国FDA批准白蛋白结合紫杉醇纳米粒注射混悬液上市以后，白蛋白纳米粒作为靶向药物载体引起临床关注。白蛋白纳米粒载药系统具有靶向、缓释，生物利用度高，减少用药过程中的不良反应等优点，其在体内主要输送到单核巨噬系统(RES系统)，具有器官被动靶向性，这对局限于RES系统的恶性肿瘤(如肝癌、骨髓瘤)的化疗具有重要意义［3］。但由于多数疾病不在RES系统中，提高白蛋白纳米粒在体内的靶向性，成为研究人员面临的重要问题［4］。叶酸是一种低分子量维生素，叶酸受体常在人癌细胞过表达，而在大多数正常组织中的表达高度限制［5］。叶酸受体作为一种肿瘤标记物，可用来实现抗肿瘤药物的靶向输送［6］。针对叶酸受体的特性以及白蛋白纳米技术在药物载体上的应用，研究人员设计出叶酸偶联白蛋白纳米粒作为主动靶向于肿瘤细胞的药物载体。本文综述了近年来叶酸偶联白蛋白纳米粒的研究概况，包括制备方法、靶向性、载药方式及其应用。

1　叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法

白蛋白表面活性氨基(暴露于白蛋白纳米粒表面的赖氨酸—氨基及末端氨基)是进行化学修饰的有效连接部位，可与叶酸发生偶联反应。文献报道的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法主要是首先制备出白蛋白纳米粒(采用去溶剂化等方法制备)和叶酸活性酯(利用二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、碳二亚胺与叶酸反应制备)，然后于碱性缓冲液中用叶酸活性酯与白蛋白表面氨基偶联制备叶酸偶联牛血清白蛋白纳米粒(叶酸-BSANPs)。产物可利用葡聚糖凝胶柱或超速离心等方法进行分离。叶酸偶联率常用2，4，6-三硝基苯磺酸显色法测定。白蛋白纳米粒径及其表面残余氨基的量是影响叶酸偶联的重要因素。Zu等［7］采用响应面分析法研究牛血清白蛋白(BSA)浓度、乙醇滴加速率、乙醇与水的比例以及交联度对牛血清白蛋白纳米粒(BSANPs)粒径大小及其表面残余氨基的数量的影响。结果表明，影响纳米粒径的主要因素为BSA浓度和乙醇的滴加速率，影响表面残余氨基的数量的因素主要为BSA浓度、乙醇的滴加速率与交联度。

目前文献报道的与叶酸偶联的白蛋白纳米粒主要是牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)。如张良坷等［8］在pH=9.0的碳酸盐缓冲液中，使BSANPs表明氨基与叶酸活性酯偶联，首次制备叶酸-BSANPs，直径约70 nm，叶酸偶联率为28.3%。陈道桢等［9］报道了叶酸偶联人血清白蛋白纳米粒(叶酸-HSANPs)的制备方法:将叶酸溶于pH=9.0 的PBS，加入EDC活化，加入含人血清白蛋白纳米粒(HASNPs)的PBS，搅拌使其反应。采用葡聚糖凝胶柱对反应液进行分离，收集淡黄色有乳光部分，叶酸偶联率为27.26%。

2　叶酸偶联白蛋白纳米粒载体的靶向性

叶酸偶联白蛋白纳米粒具有白蛋白纳米粒的被动靶向性及叶酸—叶酸受体介导的主动靶向性的双重优势，使叶酸偶联白蛋白纳米粒的靶向性增强。另外，研究发现在卵巢癌、子宫颈癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌和肾细胞癌等多种肿瘤细胞膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞，因此叶酸偶联白蛋白纳米粒的肿瘤靶向应用范围较为广泛［10］。虽然叶酸受体将叶酸转运进癌细胞的具体机制尚不清楚，但叶酸偶联物可以通过叶酸受体介导的内吞作用而被癌细胞摄取［11］。而近年来对于叶酸偶联白蛋白纳米粒的研究也表明该纳米粒子可以经过叶酸受体叶酸介导的内吞作用进入叶酸受体表达阳性的肿瘤细胞。

2.1叶酸受体叶酸介导的内吞作用张良坷等［8］研究了叶酸-BSANP对人卵巢癌细胞SKOV3的靶向性。体外实验表明，SKOV3细胞对叶酸-BSANPs的摄入量高于无叶酸修饰的BSANPs，摄入量随叶酸-BSANPs浓度的增大和培养时间的延长而增加，并对时间和浓度的增加呈现出饱和性。此外叶酸-BSANPs的摄入会受到游离叶酸的抑制，而表面未修饰叶酸的BSANPs的摄入并不受到叶酸的抑制。该研究结果显示叶酸偶联白蛋白纳米粒可通过叶酸受体介导进入SKOV3细胞。

2.2主动靶向于多种肿瘤细胞Kreuter等［12］研究显示叶酸-HSANPs可显著提高人神经母细胞瘤和鼠脑胶质瘤细胞对纳米粒的结合和摄取能力，而对正常人包皮成纤维细胞的摄取能力无影响。这表明叶酸偶联白蛋白纳米粒对多种肿瘤细胞具有主动靶向性。

3　叶酸偶联白蛋白载体的载药方式

叶酸偶联白蛋白纳米粒作为药物的主动靶向性载体，主要以物理结合和化学偶联两种方式进行载药。

3.1物理结合载药物理结合载药主要有两种方式:一种是依赖白蛋白与药物的相互作用将药物包埋于叶酸偶联白蛋白纳米颗粒中。文献报道的大多数叶酸偶联白蛋白载药体系采用该方法进行载药。Zhang等［13］制备的叶酸偶联白蛋白包载米托蒽醌纳米粒(MTO-BSA-叶酸) :将叶酸-BSANPs分散在pH=9碳酸盐缓冲液或PBS中，加入MTO室温搅拌，获得MTO-BSA-叶酸;其粒径为68 nm，载药量为9.7%±0.1%，包封率为96.6%±1.0%。另一种方法是先将药物包埋于白蛋白纳米粒中，然后在碱性环境中再与叶酸活性酯偶联。例如叶酸修饰的白蛋白包载多西紫杉醇(DT)纳米粒(叶酸-DT-BSANPs)的制备［14］:首先用去溶剂化法制备DTBSANPs，然后在pH=9碳酸盐缓冲液中与叶酸活性酯偶联制备叶酸-DT-BSA-NPs。粒径小于220 nm，药物包封率为45%±8%，载药量为14%±0.6%。

叶酸偶联白蛋白纳米粒不仅可以包载单一药物，还可以同时包载多种药物，例如同时包载卡铂和紫杉醇的叶酸—卡铂—紫杉醇白蛋白纳米靶向制剂［15］。制备方法:在含有BSA和卡铂的缓冲溶液中滴加紫杉醇乙醇溶液，制备出卡铂—紫杉醇—白蛋白纳米粒，然后与叶酸活性酯反应制备产物。粒径为199.4 nm，卡铂和紫杉醇包封率分别为91.4% 和56.1%，总载药量为21.0%。体外释放结果表明该纳米粒中紫杉醇溶出速率增加，卡铂具有缓释效果。

3.2化学偶联载药利用药物与白蛋白载体之间产生分子间化学连接形成叶酸偶联白蛋白药物。例如叶酸偶联白蛋白负载阿霉素(叶酸-BSA-DOX)的制备［16］。首先将DOX的羟基氧化为醛基，通过Schiff碱反应使其与BSA上氨基连接制备出BSADOX，然后于pH为9.5的缓冲溶液中与叶酸活性酯偶联制备叶酸-BSA-DOX。

4　叶酸偶联白蛋白纳米粒的应用

叶酸偶联白蛋白纳米粒不仅具有白蛋白纳米粒的应用优势，还具有主动靶向性优势，因此其作为一种新型理想的药物载体，其应用前景广阔。目前叶酸偶联白蛋白纳米粒最引人注目的应用还是将其作为抗肿瘤药物的载体。

4.1作为抗肿瘤药物的载体文献报道的用叶酸偶联白蛋白纳米粒包封研究的抗肿瘤药已有紫杉醇、多西紫杉醇、卡铂、米托蒽醌、表没食子儿茶素、5-氟尿嘧啶、硫酸长春碱、长春碱、10-羟基喜树碱、多柔比星(阿霉素)、2-甲氧基雌二醇、顺铂等［17～23］。用叶酸偶联白蛋白纳米粒包封的上述抗肿瘤药物的体外释放试验、体外细胞摄取实验、细胞凋亡实验及动物实验研究表明:①这些叶酸偶联白蛋白—抗肿瘤药物具有稳定性高和药物缓释的特点。②由于叶酸受体叶酸仅在肿瘤细胞高表达，在正常组织无表达或很少表达，肿瘤组织特异性高。因此相较于白蛋白纳米粒载药体系，叶酸偶联白蛋白载药体系可通过肿瘤细胞表面的叶酸受体叶酸的介导而将其所携载的抗肿瘤药物主动靶向于叶酸受体叶酸表达阳性的肿瘤细胞(如人卵巢癌细胞SKOV3、前列腺癌细胞PC-3、宫颈癌细胞HeLa、胃癌细胞SGC7901细胞、肝癌细胞SMMC-7721、人鼻咽癌细胞KB等)，从而有效减少抗肿瘤药物对正常组织和细胞的毒副作用。例如，Zhang等［23］构建的叶酸偶联的2-甲氧基雌二醇(2-ME )白蛋白纳米粒(2-ME-叶酸-BSANPs)靶向给药系统，相比于对照组2-ME和2-ME-BSANPs来说，具有更强的靶向性，可有效快速的被肝癌细胞SMMC-7721摄入细胞内。体外实验表明2-ME-叶酸-BSANPs对肿瘤细胞的抑制作用也显著大于2-ME。

4.2作为化疗、热疗、放疗三合一的靶向载体对叶酸偶联白蛋白纳米粒载药系统进行磁性修饰和放射性元素标记还可以使该载药系统对癌细胞呈现出靶向性的放疗、化疗、热疗三重杀伤作用。Chen等［24］对叶酸偶联人血清白蛋白包封Fe3O4磁性材料及顺铂的纳米粒(叶酸-CDDP/HASMNPs)进行放射性核素标记制备出188Re-叶酸-CDDP/HASMNPs［25］。放射化学纯度超过95%。该递送系统将化疗、磁感应温度上升的理疗及放射疗法相结合。体外实验表明在交变磁场下，其对癌细胞SKOV3具有靶向性的放疗、化疗、热疗三重杀伤作用。

4.3作为肿瘤诊断与检测的载体水溶性荧光量子点CdTe具有高荧光强度和良好抗光漂白性能，适合肿瘤细胞的靶向识别与荧光标记及示踪［26］。因此，包裹量子点或荧光素的叶酸偶联白蛋白纳米粒在叶酸受体表达阳性的肿瘤检测及诊断方面具有潜在应用价值。Meng等［27］利用CdTe/ZnS量子点获得叶酸偶联牛血清白蛋白量子点纳米粒(叶酸-BSA-QDs)。荧光显微镜下观察到相较于叶酸受体表达阴性的人类胚胎肾细胞(293T)，叶酸受体表达阳性的人鼻咽癌细胞KB对叶酸-BSA-QDs的摄取显著增强，并受到叶酸抑制。表明叶酸-BSA-QDs在叶酸受体表达阳性的癌症的诊断方面具有潜在应用价值。

此外，Rollett等［28］研究显示，叶酸受体表达阳性的巨噬细胞与叶酸-HSANPs的结合明显增强，而活化的滑膜巨噬细胞在风湿性关节炎中发挥关键的作用，说明叶酸-HASNPs也可成为治疗风湿性关节炎药物的潜在载体。

5　结语

叶酸偶联白蛋白纳米粒是一个稳定的药物递送系统，可以改善药物靶向于癌细胞，可作为靶向递送抗癌药物的载体。叶酸偶联白蛋白纳米粒具备白蛋白纳米粒的安全无毒、生物相容性良好、无抗原性等多种优点，其作为一种新型理想的药物载体还具有缓释、生物利用度高、靶向、可减轻抗癌药物的不良反应等优点。与白蛋白纳米粒相比其独特优点在于对于叶酸受体表达阳性的多种肿瘤细胞，叶酸偶联白蛋白纳米粒具有主动靶向性。因此，叶酸偶联白蛋白纳米粒在肿瘤治疗及肿瘤在位检测方面均具有非常重要的科学价值及应用价值。最近研究表明其还可以作为治疗关节炎药物的潜在载体。虽然叶酸偶联白蛋白纳米粒靶向药物投递系统的研究刚刚起步，尚处于细胞实验和动物实验阶段，但由于其以白蛋白为载体，生物降解性高、无毒、有主动靶向性特点，其应用前景广阔。

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(收稿日期:2015-03-17)

文章编号:1002-266X(2015) 22-0097-04

文献标志码:A

中图分类号:R730.53

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.040