线粒体tRNAleu区突变与肿瘤的发生及p53突变的关系

王贲士，乔录新，张玉林，封晓昆，陈德喜，郭洪亮(山东省肿瘤医院，济南2507;2济南大学山东医学科学院与生命科学学院; 首都医科大学附属北京佑安医院)

线粒体tRNAleu区突变与肿瘤的发生及p53突变的关系

王贲士1，2，乔录新3，张玉林3，封晓昆1，2，陈德喜3，郭洪亮1
(1山东省肿瘤医院，济南250117;2济南大学山东医学科学院与生命科学学院; 3首都医科大学附属北京佑安医院)

摘要:目的研究肿瘤患者线粒体DNA(mtDNA)中tRNAleu区序列3264位点上T→C突变与肿瘤发生及p53突变的关系。方法提取接受手术治疗的28例肝癌及35例结肠癌患者的癌组织与癌旁组织总DNA，采用PCR法扩增mtDNA中的tRNAleu区以及p53基因全长并测序。结果所有癌组织中未见3264位点T→C的突变，但有16例在其他位点发现了突变;所有癌旁组织中未见3264位点T→C的突变，有3例在其他位点发生突变。在癌组织中发现17例p53基因突变;结肠癌组织p53突变9例，其中存在tRNAleu区突变6例、无tRNAleu区突变3例，P＜0.05;肝癌组织p53突变8例，其中存在tRNAlen区突变5例，无tRNAlen区突变3例，P＜0.05。结论tRNAleu区3264位点上T→C的突变暂不能认为与肿瘤的发生存在直接关系，该区域其他位点的突变可能是由于p53突变后丧失对该基因的保护而继发产生的。

关键词:结肠癌;肝癌;线粒体; p53; tRNAleu区序列;突变

tRNAleu是线粒体重要的片段之一，该区域相关位点的突变与糖尿病、糖尿病型耳聋等代谢性疾病有着明显的联系［1］。近来有文献报道［2］，tRNAL-eu基因3264位点T→C的突变不仅能够引起糖尿病患者产生母系遗传性糖尿病，而且患者易患多发性肿瘤。但是，该位点突变与肿瘤发病的相关性国内尚无报道。因此，我们通过对肿瘤患者癌组织与癌旁组织tRNALeu序列的扩增比对，探讨该区3264位点突变与肿瘤发生的关系;同时，扩增癌组织中的p53全长序列，分析其与p53突变之间的关系。

1　资料与方法

1.1临床资料2010年7月～2011年1月山东省肿瘤医院接受结肠癌手术治疗的结肠癌患者35例。其中男20例、女15例，年龄45～64(56±2.6)岁，符合卫生部2010年颁布的《结肠癌规范化诊疗指南(试行)》中的诊断标准。2011年9月～2013年8月北京佑安医院接受肝癌切除术的肝癌患者28例。其中男17例、女11例，年龄47～61(54±2.6)岁，符合卫生部2011年颁布的《原发性肝癌诊疗规范》中的诊断标准。患者均经过术前取组织病理活检及术后肿瘤组织病理检查确诊为结肠癌以及肝癌，均以癌旁正常组织作为对照。该研究样本均无特殊病例，体检也无异常发现。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取取适量的癌组织以及癌旁组织，加入研磨器中;立即加入少量液氮，迅速研磨。基因组DNA的提取，按照DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)的说明书进行。

1.2.2tRNAleu、p53序列的扩增及序列分析设计合成tRNAleu序列扩增引物，上游引物为5'-AAGGTTCGTTTGTTCAACGA-3'，下游引物为5'-GGCCTAGGTTGAGGTTGACC-3'。PCR扩增反应体系:10×缓冲液5 μL，脱氧核苷三磷酸(Dntp) 4 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，双蒸馏水36.5 μL;反应条件: 94℃2 min，94℃20 s，50℃30 s，72℃90 s，35个循环，72℃10 min。p53基因全长扩增引物: p53 S 121为ATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT，p53 as 1302为TCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG。PCR扩增反应体系: 94℃5 min，94℃20 s，55℃30 s，72℃120 s，35个循环，72℃10 min。取扩增产物5 μL，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(120 V 10 min)，Tanon 1600R型凝胶成像仪成像分析。反应产物送北京博迈德生物技术有限公司完成纯化和测序，测序引物同PCR引物。测序结果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed比对进行序列来源鉴定。并逐一比对报告相关突变位点。

1.2.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件。两组样本率的比较采用校准χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1线粒体DNA tRNAleu序列PCR扩增结果线粒体DNA tRNAleu序列扩增条带清晰，阴性对照目标区无扩增条带(插页Ⅱ图7)，测序结果碱基峰清晰。在比对后和人的线粒体DNA中tRNAleu序列相似度最高，确认扩增片段为DNA tRNAleu区序列。p53基因PCR扩增电泳图(部分)及测序峰图见插页Ⅲ图8。

2.2癌组织与癌旁组织tRNAleu区碱基序列突变比较患者均未发现3264位点上T→C突变。结肠癌组织tRNAleu区其他位点突变10例，癌旁组织2例，突变率比较，P＜0.05。肝癌组织tRNAleu区其他位点突变6例，癌旁组织1例，突变率比较，P＜0.05。

2.3癌组织p53有效突变位点统计癌组织中发现17例p53基因突变;结肠癌组织p53突变9例，其中tRNAleu区突变6例，无tRNAleu区突变3例，P＜0.05;肝癌组织p53突变8例，其中tRNAleu区突变5例，无tRNAleu区突变3例，P＜0.05。

3　讨论

mtDNA缺乏组蛋白保护和有效的损伤修复系统，又处于线粒体的高氧化自由基环境中，容易出现功能结构和含量的改变［3～10］。tRNA尽管只占线粒体基因组的10%，但其突变所导致的疾病占所有疾病mtDNA突变的50%，可见其在人类疾病中的重要性［11］。其中，线粒体tRNAleu则通过一个尚未明确的机制与大量的人类疾病存在联系［12］。最近的研究表明，mtDNA突变不断积累在肿瘤的发生、发展中起重要作用［13～16］。因此，专家们怀疑肿瘤患者中线粒体功能障碍是由于mtDNA的3264位点突变诱导了与肿瘤发生有关的氧化应激，或使肿瘤细胞Caspase级联反应紊乱［14，15］。

本研究未在肝癌、结肠癌组织线粒体DNA tRNAleu区发现3264位点上的T→C突变。因此，我们尚且认为文献中所报道的病例是个案特例，暂不能证明3264位点上的T→C突变与结肠癌、肝癌的发病存在直接关系。与此同时，我们发现该区域还存在其他位点的突变，研究显示该区域相关位点的突变与家族性糖尿病有关［11］。但是，根据相应患者的病例资料未发现该区突变相关的遗传性疾病。同时，我们将癌组织与癌旁组织对比发现，癌组织的突变率明显高于癌旁组织。根据以上两点我们可以推测该区域的突变可能是在肿瘤发生后的继发性突变［16］。众所周知，肿瘤的发生与p53基因的突变有关，文献报道p53的5、6、7、8外显子为其高突变区且与肿瘤的发生有着密切联系［12］。p53对肿瘤的抑制起到核心作用，在细胞凋亡、细胞周期调控DNA修复中同样也起到中心作用［2］。同时，p53突变也对肿瘤的预后与转移有影响，如大肠癌的肝转移［12］。据文献报道［2］，p53不仅能够维持细胞核DNA的稳定，同时对线粒体DNA的稳定性也有重要作用。在线粒体中，p53蛋白参与到蛋白的转录及复制的调节中，并且维持基因的稳定性。p53蛋白在线粒体中能够触动线粒体的凋亡，p53的抑制将会使能量代谢从线粒体呼吸切换到有氧糖酵解，从而使肿瘤生长于低氧环境。最新研究表明［17］，线粒体基因的稳定性通过p53定位于线粒体，并刺激线粒体的单碱基切除修复通路来维持。在各种刺激下，P53能够与线粒体内的DNA聚合酶γ相互作用，继而启动碱基切除修复，切除损伤基因和嘌呤、嘧啶位点，纠正线粒体DNA上的突变，从而使线粒体DNA维持稳定［3］。也有研究认为，p53绑定区域与线粒体16srDNA区域结合，该区域的任何变化(例如R273H)都可能使DNA的绑定结合，妨碍mtDNA的转录和复制［4］。当结肠癌组织中的p53基因发生突变，p53基因不能正常表达p53蛋白时，则进一步影响到p53蛋白以及其下游蛋白的对线粒体DNA的保护功能，从而使其突变率升高［13，18］。因此，我们对该标本又进一步扩增了p53的全长。结果显示，25.7%的结肠癌患者存在p53突变，同时有28.5%的肝癌患者存在p53突变。将两者的p53突变与tRNAleu区突变做对比，差异有统计学意义(P＜0.05)，故而我们初步推测p53突变与tRNAleu区的突变存在关系。tRNAleu区域的突变与细胞的代谢存在重要关系［5，19］，因此，研究肿瘤组织内该区域的高突变率可能对肿瘤细胞的代谢以及肿瘤患者的预后有重要意义。

综上所述，mtDNA上tRNAleu区内3264位点上T→C的突变暂不能认为其与肿瘤发生存在直接关系。该区域在癌组织内的突变率明显高于癌旁组织，其很可能与癌组织中的p53突变有关，具体这些突变与p53突变的相互作用机制以及对癌症患者预后的影响还需要进一步研究。

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Relationships of mitochondrial tRNAleu mutations with tumorigenesis and p53 mutation

WANG Ben-shi1，QIAO Lu-xin，ZHANG Yu-lin，FENG Xiao-kun，CHEN De-xi，GUO Hong-liang
(1 Tumor Hospital of Shandong Province，Jinan 250117，China)

Abstract:Objective To investigate the relationships of T→C mutation of 3264 site in tRNAleu region of mitochondrial DNA(mtDNA) with tumorigenesis and p53 mutation.Methods The whole DNA was extracted from carcinoma and adjacent tissues of 28 patients with liver carcinoma and 35 patients with colon cancer.Then tRNAleu region of mtDNA and p53 gene were amplified by PCR and sequenced.Results No T→C mutation was found in 3264 site，but 16 cases of mutations in the other sites were discovered in the carcinoma tissues.No T→C mutation was found in 3264 site，but 3 cases of mutations were discovered in the adjacent tissues.Seventeen cases of p53 gene mutation were found in the carcinoma tissues; 9 cases of p53 mutation were found in patients with colon carcinoma，including 6 cases of tRNAleu mutation and 3 cases of non-tRNAleu mutation(P＜0.05) ; and 8 cases of p53 mutation were found in patients with liver cancer，including 5 cases of tRNAleu mutation and 3 cases of non-tRNAleu mutation(P＜0.05).Conclusions The T→C mutation in 3264 site of tRNAleu region can't be considered to have relationship with tumorigenesis.The mutations in other sites of tRNAleu region are due to p53 mutation，so the gene loses its protection，and thus the mutation occurs.

Key words:colonic carcinoma; liver carcinoma; mitochondria; p53; sequence of tRNAleu region; mutation

(收稿日期:2014-06-17)

通信作者简介:郭洪亮(1963-)，男，主任医师，研究员，主要研究方向为大肠癌及胃癌的基础与临床。E-mail: hliangbb@163.com

作者简介:第一王贲士(1988-)，男，硕士研究生，主要研究方向为大肠癌的基础与临床。E-mail: wangbishi1521@163.com

基金项目:国家十二五重大专项(2012ZX10001004-002) ;国家科技支撑计划课题(2012BAI15B00) ;“十二五”艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项(2012ZX10001-003-003) ;山东省医学科学院级科技计划(2014-24)。

文章编号:1002-266X(2015) 20-0007-03

文献标志码:A

中图分类号:R73; Q343.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.003