妊娠早期外周血白细胞线粒体DNA含量与妊娠糖尿病患病率的关系

陈旖鹛，张彤，李万根，陈勇霞，牛建民，王芳，李子昊(广州医科大学附属第二医院，广州060;南方医科大学第三附属医院; 广东省妇幼保健院;广州医科大学附属第三医院; Alington Friends School)

妊娠早期外周血白细胞线粒体DNA含量与妊娠糖尿病患病率的关系

陈旖鹛1，张彤2，李万根1，陈勇霞1，牛建民3，王芳4，李子昊5
(1广州医科大学附属第二医院，广州510260;2南方医科大学第三附属医院; 3广东省妇幼保健院;4广州医科大学附属第三医院;5 Alington Friends School)

摘要:目的观察妊娠早期外周血白细胞线粒体DNA(mtDNA)含量是否与妊娠糖尿病(GDM)患病相关。方法选取妊娠＜12孕周者206例，应用实时定量PCR法检测研究对象外周血妊娠早期白细胞mtDNA含量的值，以mtDNA与核DNA(nDNA)含量比值(mtDNA/nDNA)表示;根据mtDNA含量中位数分为低mtDNA含量组(n=103)和高mtDNA含量组(n=103)。测定妊娠早期空腹葡萄糖、空腹胰岛素等葡萄糖代谢指标，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR) ;妊娠24～28周行口服葡萄糖耐量试验，分别统计两组GDM患病率。结果低mtDNA含量组和高mtDNA含量组妊娠24～28周GDM患病率分别为10.7%和6.8%，P＞0.05;两组妊娠早期空腹葡萄糖、胰岛素和HOMA-IR比较，P均＞0.05。结论妊娠早期外周血白细胞mtDNA含量与GDM无明显相关性。

关键词:妊娠并发症;线粒体DNA含量;妊娠糖尿病;妊娠早期

妊娠糖尿病(GDM)指妊娠后首次出现的不同程度糖耐量减低的疾病，发生率各国报道为1%～21%［1，2］，近年有明显增高趋势。母体GDM不仅危害到母体本身及宫内胎儿的成长，也对胎儿出生后健康造成不利影响;因为胎儿长时间暴露在高血糖的子宫内环境中，其将来发生代谢性疾病的风险大大增高［3］，如易发生代谢综合征等。找出GDM患病风险相关指标并及时给予干预，对预防GDM发病有重要意义。有报道2型糖尿病(T2DM)及糖尿病前期患者的白细胞线粒体DNA(mtDNA)数量下降，推测mtDNA含量下降参与了T2DM发病过程［4］。因为GDM和T2DM具有相似的发病机制［5］，所以本文通过检测妊娠早期外周血白细胞中mtDNA含量和葡萄糖代谢指标，分析mtDNA含量变化是否也参与GDM的发病过程。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2012年7月～2013年6月因停经就诊于广州医科大学附属第二医院妇科门诊确诊妊娠者206例，年龄(27.5±3.9)岁，均为妊娠早期(＜12孕周)，并签署知情同意书。排除糖尿病合并妊娠(第一次孕检FPG≥7.0 mmol/L)，患有代谢综合征、肿瘤、心肝肾和其他系统严重疾病等可能影响实验结果者，抽烟史或规律服药史。

1.2方法

1.2.1mtDNA检测方法妊娠早期抽取研究对象空腹静脉血2 mL，以EDTA抗凝;离心分离血浆后，于－80℃冰箱保存。使用天根生化(北京)科技有限公司的血液基因组提取试剂盒(离心柱型)提取血液基因组DNA，－80℃冰箱保存。采用实时定量PCR法测定研究对象外周血白细胞mtDNA相对含量，采用瑞士罗氏公司的LightCycler 480及原厂配套试剂SYBR GREEN I Master染料进行检测。引物序列参照文献报道［6］，mtDNA的引物序列:正向引物为mtF3212(5'-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3')，反向引物为mtR3319(5'-TGGCCATGGGTATGTTGTTAA-3') ; 18 S RNA为核DNA(nDNA)内参照，正向引物为18 S 1546F(5'-TAGAGGGACAAGTGGCGTTC-3')，反向引物为18 S 1650R(5'-CGCTGAGCCAGTCAGTGT-3')。mtDNA相对含量以mtDNA/nDNA表示。反应体系(15 μL) : ddH2O 4.9 μL，SYBR Green I Master 7.5 μL，PCR正向引物(10 μmol/L) 0.3 μL，PCR反向引物(10 μmol/L) 0.3 μL，待测DNA模板2 μL。反应条件: 95℃预变性10 min; 95℃变性10 s，60℃退火20 s和72℃延伸20 s，共40个循环。每个样本重复3次，设置无模板阴性对照以排除假阳性。实验数据应用2－ΔCt进行处理，ΔCt=Ct(mtDNA)－Ct(nDNA)，2－ΔCt表示mtDNA和nDNA起始拷贝数比值作为每个标本的mtDNA相对含量，其中Ct为标本扩增到规定阈值时PCR循环数。

1.2.2葡萄糖代谢指标检测方法使用德国罗氏公司的COBAS8000全自动生化分析仪及原厂配套试剂，采用葡萄糖氧化酶—过氧化物酶法检测空腹葡萄糖，采用放射免疫分析法检测空腹胰岛素，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。HOMA-IR=空腹葡萄糖(mmol/L)×空腹胰岛素(μU/L)/22.5。

1.2.3GDM判定方法妊娠24～28周时，行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，分析GDM患病率。GDM诊断参考2010年国际妊娠期糖尿病专家组制定的标准［7］:妊娠24～28周时，OGTT 0 h≥5.1 mmol/L 或1 h≥10.0 mmol/L或2 h≥8.5 mmol/L，任意一点血糖达到以上标准可诊断。

1.2.4统计学方法采用SPSS20.0统计软件。非正态分布的计量资料以中位数(最小值，最大值)表示，采用秩和检验;计数资料以频率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1实时荧光定量PCR扩增效率为建立实时定量PCR合适的反应条件，采用模板DNA倍比稀释后进行mtDNA和nDNA的扩增;制作相对标准曲线后分析，显示出良好的Ct值与起始模板各稀释量的对数的直线相关关系;线粒体基因和参照基因的扩增效率基本一致，可以应用2－ΔCt进行相对定量。研究中采用适当的DNA模板浓度使各样本的扩增曲线都到达平台期扩增曲线均呈S形，同一份标本多次扩增曲线重叠，结果有可重复性，阴性对照无扩增(插页Ⅳ图11)。

2.2mtDNA检测结果全体研究对象的mtDNA含量为3.5(0.1，12.9)，根据mtDNA合并中位数分为两组，其中低mtDNA组(103例)为1.9(0.1，3.5)，高mtDNA组(103例)为5.3(3.5，12.9)，其年龄、妊娠时间具有可比性。

2.3两组妊娠早期空腹血糖、胰岛素及HOMR-IR比较见表1。

2.4两组GDM发生情况比较追访病例至28周，全体206例样本中，流产56例，糖耐量正常132例，GDM 18例，低mtDNA组发生GDM 11例(10.7%)，高mtDNA为7例(6.8%)，P＞0.05。

3　讨论

线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要场所，为细胞的活动提供了能量。mtDNA是位于线粒体的DNA，因为线粒体的基因与线粒体的氧化磷酸化作用密切相关，因此，mtDNA质量及数量的改变均关系到细胞内的能量供应。

骨骼肌或胰岛的mtDNA质变(突变或缺失)和量变造成线粒体合成酶缺陷，导致ATP合成障碍、能量供应不足，使细胞有氧处理葡萄糖的能力降低，导致骨骼肌的胰岛素抵抗［8］或胰岛的胰岛素分泌缺陷［9］，参与T2DM与GDM的发生。mtDNA含量可作为线粒体功能状态的观测指标［10］，外周血取材方便，所以白细胞mtDNA含量改变可作为T2DM与GDM等以胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷为特征的疾病患病风险预测。

然而，我们的研究结果并不支持妊娠早期妇女外周血白细胞mtDNA含量改变是GDM的易感因素，也不支持其与同一时期的空腹胰岛素、空腹血糖等葡萄糖代谢指标有关联。我们的总人群GDM患病率为8.7%，与文献报道基本一致［1，2］。本研究结果不支持mtDNA含量改变与GDM及葡萄糖代谢指标有关联，分析其原因:①有研究在32～36孕周妇女中检测到GDM组和非GDM组外周血白细胞mtDNA含量不同［11］，而我们测定的是＜12孕周的妇女，可能因为mtDNA含量改变是多因素长时间作用的结果，所以在妊娠早期尚未出现。②大龄、高脂血症、高血压等可影响mtDNA含量［12］，T2DM患者更倾向于这些易感因素的累积，而GDM特别是妊娠早期合并这些代谢紊乱的较少。③Lee等［4］发现，2 a内发展为T2DM患者外周血白细胞mtDNA只比普通人群减少25%～35%，但T2DM患者的骨骼肌mtDNA含量可比普通人群减少50%［13］，说明骨骼肌等其他代谢性组织的mtDNA含量改变对葡萄糖代谢的影响大于外周血白细胞的mtDNA含量改变对葡萄糖代谢的影响。④人群的差异。韩国多个研究得出mtDNA含量减少与T2DM患病有关［4，14］，而英国高加索人群的研究得出mtDNA含量在T2DM和非T2DM人群中无统计学差异的结论［15］，推测各人种之间对于mtDNA减少导致葡萄糖代谢紊乱的敏感性有差异。⑤两组孕妇妊娠早期的空腹血糖、胰岛素和HOMA-IR没有区别，也可能是最后GDM患病率没区别的原因之一。

总之，本研究证明妊娠早期外周血白细胞的mtDNA含量变化不影响GDM患病风险。

参考文献:

［1］Association AD.Diagnosis and classification of diabetes mellitus ［J］.Diabetes Care，2010，33(Suppl 1) : 62-69.

［2］Wei Y，Yang H，Zhu W，et al.International Association of Diabetes and Pregnancy Study Group criteria is suitable for gestational diabetes mellitus diagnosis: further evidence from China［J］.Chin Med J，2014，127(20) : 3553-3556.

［3］Clausen TD，Mathiesen ER，Hansen T，et al.High prevalence of type 2 diabetes and pre-diabetes in adult offspring of women with gestational diabetes mellitus or type 1 diabetes: the role of intrauterine hyperglycemia［J］.Diabetes Care，2008，31(2) : 340-346.

［4］Lee HK，Song JH，Shin CS，et al.Decreased mitochondrial DNA content in peripheral blood precedes the development of non-insulin-dependent diabetes mellitus［J］.Diabetes Res Clin Pract，1998，42(3) : 161-167.

［5］杨桦.胰岛素抵抗与妊娠期糖尿病及2型糖尿病的相关性研究［J］.中国优生与遗传杂志，2007，15(10) : 124-125.

［6］Bai RK，Perng CL，Hsu CH，et al.Quantitative PCR analysis of mitochondrial DNA content in patients with mitochondrial disease ［J］.Ann NY Acad Sci，2004，(1011) : 304-309.

［7］International Association of Diabetes and Pregnancy Study Groups Consensus.Panel，Metzger BE，Gabbe SG，et al.International association of diabetes and Pregnancy study groups recommendations on the diagnosis and classification of hyperglycemia in pregnancy［J］.Diabetes Care，2010，33(3) : 676-682.

［8］Ozawa T.Mechanism of somatic mitochondrial DNA mutations associated with age and diseases［J］.Biochim Biophys Acta，1995，1271(1) : 177-189.

［9］Kadowaki T，Kadowaki H，Mori Y，et al.A subtype of diabetes mellitus associated with a mutation of mitochondrial DNA［J］.New Engl J Med，1994，330(14) : 962-968.

［10］Malik AN，Czajka A.Is mitochondrial DNA content a potential biomarker of mitochondrial dysfunction［J］.Mitochondrion，2013，13(5) : 481-492.

［11］Crovetto F，Lattuada D，Rossi G，et al.A role for mitochondria in gestational diabetes mellitus［J］.Gynecological Endocrinology，2013，29(3) : 259-262.

［12］Huang CH，Su SL，Hsieh MC，et al.Depleted leukocyte mitochondrial DNA copy number in metabolic syndrome［J］.J Atheroscler Thromb，2011，18(10) : 867-873.

［13］Antonetti DA，Reynet C，Kahn CR.Increased expression of mitochondrial-encoded genes in skeletal muscle of humans with diabetes mellitus［J］.J Clin Invest，1995，95(3) : 1383-1388.

［14］Lim S，Park KS，Kim MS，et al.Relationship between various surrogate indices of insulin resistance and mitochondrial DNA content in the peripheral blood of 18 healthy volunteers［J］.Mitochondrion，2001，1(1) : 71-77.

［15］Singh R，Hattersley AT，Harries LW.Reduced peripheral blood mitochondrial DNA content is not a risk factor for Type 2 diabetes ［J］.Diabet Med，2007，24(7) : 784-787.

·基础研究·

Relationship between white blood cell mitochondrial DNA content in first trimester of pregnancy and prevalence of gestational diabetes mellitus

CHEN Yi-mei1，ZHANG Tong，LI Wan-gen，CHEN Yong-xia，NIU Jian-min，WANG Fang，LI Zi-hao
(1 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China)

Abstract:Objective To investigate whether white blood cell mitochondrial DNA(mtDNA) content in the first trimester of pregnancy is associated with gestational diabetes mellitus(GDM).Methods Data and blood samples were collected from 206 females who were diagnosed as pregnancy within 12 weeks.The mtDNA quantification using nuclear DNA(nDNA) as a reference was analyzed by real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR).According to the median value of the mtDNA/nDNA ratio，the subjects were divided into two groups: lower mtDNA content group(n=103) and higher mtDNA content group(n=103).The fasting glucose and fasting insulin were measured and homeostasis model assessment of IR(HOMA-IR) was calculated.Oral glucose tolerance test(OGTT) was taken between week 24 and 28 of gestation，and the prevalence of GDM in the two groups was observed.Results In the first trimester of pregnancy from week 24 to week 28，the prevalence of GDM in the lower mtDNA content group and higher mtDNA content group was 10.7% and 6.8%，respectively(P＞0.05).There was no statistical significance in fasting glucose，fasting insulin and HOMA-IR between thess two groups(all P＞0.05).ConclusionThe content of white blood cell mtDNA in the first trimester of pregnancy is not a risk factor for GDM.

Key words:pregnancy complications; mitochondrial DNA content; gestational diabetes mellitus; first trimester of pregnancy

(收稿日期:2015-03-03)

通信作者简介:李万根(1966-)，男，教授，广州医科大学附属第二医院内分泌科主任，主要研究方向为妊娠糖尿病。E-mail: liwg660@126.com

作者简介:第一陈旖鹛(1988-)，女，住院医师，主要研究方向为妊娠糖尿病。E-mail: 512320401@ qq.com

基金项目:广东省广州市科技计划项目(12C22021649)。

文章编号:1002-266X(2015) 20-0022-03

文献标志码:A

中图分类号:R714.25

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.007