Diversin在人脑星形细胞瘤组织中的表达及其对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响

潘起晨，王明昊，班允超，崔晓，王运杰(中国医科大学附属第一医院，沈阳110001)

Diversin在人脑星形细胞瘤组织中的表达及其对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响

潘起晨，王明昊，班允超，崔晓，王运杰
(中国医科大学附属第一医院，沈阳110001)

摘要:目的观察人脑星形细胞瘤组织中Diversin表达及其对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其作用机制。方法采用免疫组化法检测105例人脑星形细胞瘤组织中的Diversin。通过siRNA沉默技术调控星形细胞瘤U87细胞中Diversin的表达，并以MTT、Transwell、Western blot、实时荧光定量PCR等方法检测肿瘤细胞的增殖和迁移能力及细胞Diversin、p-JNK、MMP-9的表达。结果Diversin在星形细胞瘤的组织学分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中的表达阳性率分别为0、19.2%、48.9%，P均＜0.01。对照组与干扰组U87细胞增殖指数分别为2.01±0.42、1.62±0.14，P＜0.05;穿膜细胞数分别为(57±6)、(39±6)个，P＜0.05; Diversin、p-JNK、MMP9 mRNA及蛋白表达均下降，P均＜0.05。结论Diversin可随星形细胞瘤组织学分级而升高，可作为判断其生物学行为的标记物; Diversin能够通过JNK途径促进人脑星形细胞瘤的增殖与侵袭，并可能成为治疗该肿瘤的新靶点。

关键词:锚蛋白重复结构域蛋白;免疫组织化学;神经胶质瘤;生物学行为

星形细胞瘤的预后除与肿瘤发生部位、大小、组织学类型和分级有关外，也与肿瘤细胞的生物学行为(增殖、侵袭等)密切相关［1，2］。Diversin又称锚蛋白重复结构域蛋白6(ANKRD6)，是果蝇属Diego蛋白在哺乳动物中的同源异构体［3］。研究表明，Diversin在小鼠神经母细胞和成熟的神经元细胞中有表达，且能够促进神经母细胞的增殖［4］。但是，其在正常的胶质细胞和星形细胞瘤中的表达情况及作用仍不清楚。本研究检测了人脑星形细胞瘤组织中Diversin的表达，分析其与临床病理因素之间的关系;通过siRNA调控肿瘤细胞中Diversin的表达，观察其对胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响，并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料2007～2012年中国医科大学附属第一医院手术切除的人脑星形细胞瘤组织蜡块105例，患者中男63例，女42例;年龄35～70岁，平均53.4岁。患者术前均未行放化疗，病理诊断和分型(分级)参照2003 WHO标准，研究获得了伦理委员会的同意及许可。

1.2方法

1.2.1人脑星形细胞瘤组织中Diversin表达检测

采用免疫组化法。将石蜡组织块切成4 μm厚的切片，脱蜡、脱水，按S-P法和抗体说明操作。一抗:小鼠抗人单克隆抗体Diversion(1∶150，Santa Cruz Biotechnology，USA)，以PBS为空白对照。选肿瘤细胞阳性染色集中区域，每张切片计数400个肿瘤细胞，由两名病理医师双盲观测。Diversion阳性表达位于细胞核。按阳性细胞百分率分为阴性(＜5%)、阳性(5%～25%)、强阳性(≥26%)［5］。

1.2.2细胞培养及转染选择ATCC细胞库星形细胞瘤U87细胞(Manassas，USA)，用含10%热灭活新鲜小牛血清DMEM(Invitrogen，USA)、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的培养基，在37℃、5% CO2的条件下培养待用。转染前24 h将细胞按50%密度接种于24孔板。质粒: ON-TARGETplus diversin siRNA 和ON-TARGETplus Non-Targeting siRNA购自Dharmacon公司(USA)。转染试剂: DharmaFECT1(Qiagen，USA)。同时转染空质粒作为对照。转染48 h后采用Western blot方法检测干扰效率。

1.2.3细胞增殖观察采用MTT法。将单细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL含1× 103个细胞，培养24 h;每孔加入MTT(5 mg/mL，Sigma，USA)培养4 h，吸去上清液;加入150 μL DMSO(Sigma，USA)，振荡10 min; 490 nm波长下测定各孔光吸收值，以不含细胞的等体积培养基作对照。绘制细胞生长曲线，计算增殖指数(PI)。

1.2.4细胞侵袭能力观察采用Transwell细胞侵袭实验［6］。用预冷无血清DMEM培养基以1∶5稀释Matrigel(BD Biosciences，USA)，将转染24 h后的细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为3×105/mL，取100 μL加入上室(孔径8 μm，Costar，USA)，下室加600 μL含10%小牛血清DMEM培养基。37℃、5% CO2孵箱中培养18 h后吸尽培养基，PBS清洗后以甲醇室温固定15 min;用棉签轻擦掉上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜。取下微孔膜，至载玻片上，镜下计数细胞数，实验重复3次，取均值。

1.2.5Diversin、P-JNK、MMP-9蛋白检测采用Western blot法。收集培养细胞，加入裂解液充分裂解; 4℃下12 000 r/min离心30 min，提取上清。上样蛋白60 μg，电泳(12% SDS-PAGE凝胶)、转印(50 V，120 min)，5%正常小牛血清封闭。一抗:小鼠抗人单克隆抗体Diversin(1∶500，Santa Cruz)、MMP9、p-JNK(1∶1 000，Cell Signaling)、内参GAPDH(1∶2 000，Santa Cruz)。4℃孵育过夜，分别与对应的二抗(1∶2 500，Santa Cruz，USA)室温孵育2 h，ECL显色并采集图像;测定灰度值，计算目的蛋白与内参灰度值的比值。

1.2.6Diversin、P-JNK、MMP-9 mRNA检测采用实时荧光定量PCR法。转染24 h后收集细胞，使用TRIzol试剂提取RNA，采用ABI high capacity cDNA RT kit(Applied Biosystems)进行反转录。使用ABI7900实时定量PCR仪，内参采用β-actin。定量PCR反应条件: 95°C 30 s，95°C 5 s，40个循环，60 ℃30 s。Diverxin上游引物为5'-CCCCTAAGAGATCCTTCAGCAG-3'，下游引物为5'-CCACACGCTGTCAGAGGATG-3'; p-JNK上游引物为5'-GCTGGAGGTCTGCGAGGA-3'，下游引物为5'-ACAGGAAGCGGTCCAGGTAGT-3'; MMP9上游引物为5'-ACGGTGGTGGAGGAGCTCTT-3'，下游引物为5'-CGGTTGACGCTCTCCACAC-3';β-actin上游引物为5'-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3'，下游引物为5'-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'。以2－ΔΔCt计算mRNA的相对表达量。

1.2.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Diversin在人脑星形细胞瘤组织中的表达105例患者中，Diversin阳性表达33例。其中，组织学分级Ⅰ级的星形细胞瘤Diversin表达阳性率为0(0/6)，Ⅱ级为19.2%(10/52)，Ⅲ～Ⅳ级为48.9%(23/47)，P均＜0.01。见插页Ⅱ图5。

2.2干扰Diversin对U87细胞增殖和侵袭的影响

转染特异性siRNA后U87细胞Diversin的mRNA和蛋白表达均明显下降，干扰效率为69.5%。对照组与干扰组U87细胞PI分别为2.01±0.42、1.62 ±0.14，P＜0.05;穿膜细胞数分别为(57±6)、(39 ±7)个，P＜0.05。见插页Ⅱ图6。

2.3干扰Diversin对U87细胞Diversin、p-JNK和MMP-9表达的影响见表1。

表1　两组U87细胞Diversin、p-JNK、MMP-9表达比较(±s)

组别蛋白对照组　0.82±0.21　0.18±0.02　0.96±0.15　0.17±0.04　0.9 Diversin mRNA 蛋白p-JNK mRNA 蛋白MMP-9 mRNA 2±0.21　0.19±0.07干扰组　0.25±0.05　0.14±0.03　0.51±0.13　0.12±0.01　0.37±0.08　0.12±0.03 t 11.870　4.332　5.125　8.721　8.773　12.432 P ＜0.001　0.017　0.021　0.008　0.018　＜0.001

3　讨论

目前，对Diversin在肿瘤中的作用及机制研究尚少［7］。Diversin在胚胎发育过程中可抑制经典的Wnt/β-catenin通路，同时可激活非经典的Wnt/PCP通路［8，9］，而Wnt通路与许多肿瘤的发生、发展密切相关。Makiko等［4］发现，在新生小鼠和成鼠脑内，Diversin表达于室下区和海马区的神经母细胞和成熟神经元，并对其生物学行为具有一定影响。本研究结果显示，Diversin表达主要存在与细胞核中，且与肿瘤组织学分级密切相关。

动物实验证实，Diversin可促进小鼠神经母细胞增殖和迁移［10］。另有研究发现，在胚胎发育过程中Diversin调节斑马鱼胚胎的原肠胚运动以及控制心脏前体的融合是通过非经典Wnt/JNK通路实现的［7］。该研究认为，Diversin转移入核后可以和转录调控因子AF9相互作用，进而促进JNK活性。在人胚肾293细胞系中，Diversin和Dishevelled的表达可以协同增强JNK的活性［11］。因此，推测Diversin促进星形细胞瘤的增殖和侵袭的能力与其激活JNK通路有关［12］。本研究利用基因沉默技术干扰Diversin表达后，U87细胞增殖和侵袭能力受到明显抑制;同时发现，Wnt/PCP通路中的关键因子p-JNK及其下游靶因子MMP-9、mRNA和蛋白表达降低。以往研究显示，MMP9参与癌细胞的侵袭和转移［13］，其表达降低将抑制神经胶质瘤细胞生长［14，15］;而JNK活化后可通过调控Cdc25c基因而导致细胞周期异常［16］。可见，Diversin发挥其促进星形细胞瘤增殖和侵袭能力与其激活JNK通路有密切关系。因此，Diversin可作为星形细胞瘤生物学行为的标记物，并可能成为治疗该肿瘤的新靶点。

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Expression of Diversin in human astrocytomas and its relationships with proliferation and invasion of tumor cells

PAN Qi-chen，WANG Ming-hao，BAN Yun-chao，CUI Xiao，WANG Yun-jie
(The First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China)

Abstract:Objective To observe the expression of Diversin in human astrocytomas and its relationships with proliferation and invasion of tumor cells，and to investigate its mechanism.Methods The expression of Diversin was detected by immunohistochemical method in 105 cases of astrocytoma tissues.Small interfering RNA(siRNA) knockdown was performed in U87 cell line to regulate the Diversin expression.MTT，Transwell，Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the cell proliferation and migration ability as well as the expression of Diversin p-JNK and MMP-9.Results The positive expression rates of Diversin in the histological gradeⅠ，ⅡandⅢof astrocytoma were 19.2% and 48.9%(all P＜0.01).The proliferation indexes of U87 cells in the control and interference groups were 2.01 ±0.42 and 1.62±0.14(P＜0.05)，and the cells moved through the membrane were(57±6) and(39±6)(P＜0.05).The protein and mRNA expression of Diversin p-JNK and MMP9 was significantly decreased(all P＜0.05).Conclusions Diversin increases with the increased histological grades of astrocytoma and it may be used as the biological behavior marker of astrocytomas.Meanwhile，Diversin can promote the proliferation and invasion of astrocytomas by the way of JNK，and thus it can be a new target for treatment of the tumor.

Key words:Diversin; immunohistochemistry; glioma; biological behavior

(收稿日期:2014-10-09)

通信作者简介:王运杰(1955-)，男，主任医师，主要研究方向为神经胶质瘤。E-mail: wyj023@ vip.sina.com.cn

作者简介:第一潘起晨(1982-)，男，住院医师，主要研究方向为神经胶质瘤。E-mail: panqichen@163.com

基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(2014021066)。

文章编号:1002-266X(2015) 20-0004-03

文献标志码:A

中图分类号:R739.4

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.002