miR-200c基因重组慢病毒载体质粒构建及其人结肠癌多药耐药动物模型的建立

刘冲，隋华，朱惠蓉，李冬，李琦(同济大学附属同济医院，上海00065;上海中医药大学附属曙光医院)

miR-200c基因重组慢病毒载体质粒构建及其人结肠癌多药耐药动物模型的建立

刘冲1，隋华2，朱惠蓉2，李冬1，李琦2
(1同济大学附属同济医院，上海200065;2上海中医药大学附属曙光医院)

摘要:目的构建共同表达人miR-200c基因和荧光素酶基因的慢病毒(Lentivious)表达载体质粒，实现该重组体在人结肠癌多药耐药细胞中的稳定整合以及动物模型的建立，为进一步研究miR-200c调控大肠癌多药耐药提供实验基础。方法将miR-200c基因克隆至慢病毒pGC-Lentivirus表达载体中，测序鉴定后，包装重组慢病毒表达质粒，并进行滴度测试。利用细胞转染技术，将携带miR-200c过表达的慢病毒载体质粒转染到人结肠癌多药耐药细胞株HCT-116/L-OHP中，并接种于裸鼠皮下，以空病毒载体作为对照。待肿瘤生长2周后，随机分为4组，分别给予生理盐水和奥沙利铂(L-OHP)，4周后处死裸鼠，剥取肿瘤，测量肿瘤体积。结果病毒滴度测试最佳滴度为2×108TU/mL。qPCR结果显示，转染miR-200c-Lentivirus病毒质粒的人结肠癌耐药细胞中miR-200c表达高于转染空载体组以及空白对照组，P均＜0.01。活体成像观察证实，带有荧光素酶的HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc细胞在动物体内可被快速而灵敏的检测到，可以准确地观察肿瘤的生长情况。与HCT-116/L-OHP-luc组相比，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc组对L-OHP的敏感性更强，P＜0.05。结论成功构建携带人miR-200c基因慢病毒载体质粒，实现重组体在人结肠癌HCT-116/L-OHP多药耐药细胞中的稳定整合，并建立了带有荧光素酶miR-200c过表达的人结肠癌多药耐药动物模型。

关键词:结肠癌;多药耐药;微小核糖核酸;慢病毒载体;动物模型;活体成像

大肠癌多药耐药耐药的发生和发展是一个涉及多基因、多阶段、多因素异常积累且相互作用的复杂过程［1，2］。近年来研究发现，miRNA在细胞增殖、分化、肿瘤的血管形成和转移等方面起着重要的作用［3～5］。有研究表明，miR-200c的下调参与肿瘤多药耐药的发生、发展［6］，但是具体的调控机制尚不明确。2013年10月～2014年10月进行本研究，在构建携带miR-200c基因慢病毒载体质粒的基础上，将其转染人结肠癌耐奥沙利铂(L-OHP)多药耐药细胞株HCT-116/L-OHP，筛选稳定表达miR-200c的HCT-116/L-OHP，并建立人结肠癌多药耐药的动物模型，为临床多药耐药研究奠定实验基础。

1　材料与方法

1.1材料扩增miR-200c材料为上海吉凯基因化学技术有限公司提供克隆模板; GV209靶点筛选系统慢病毒表达载体及包装质粒(上海吉凯基因化学技术有限公司) ; Taq DNA聚合酶、4×dNTP(Takara公司) ; DNA连接酶、限制性内切酶Age I和EcoR I(NEB公司) ; RNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒(QIAGEN公司) ; Lipofecter2000脂质体转染试剂(碧云天公司) ; Marker、低熔点琼脂糖(上海生物工程公司)。Babl/c/nu裸鼠，雄性，体质量(18±2) g，SPF级，购自中科院上海实验动物中心，合格证编号: SCHK(新) 2008-0016。实验前在实验室常规饲养1周。293T细胞株、HCT-116/LOHP及其亲本株HCT-116，由上海中医药大学中西医结合肿瘤介入研究所保存。

1.2方法

1.2.1慢病毒载体的构建及鉴定将慢病毒pHelper-GV209进行Age I酶切，线性化处理; 1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段，并回收条带。将miR-200c基因PCR产物交换进入线性化慢病毒载体，加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为1∶3～1∶9，设置阳性对照和自连对照。将构建好的载体质粒转染大肠杆菌DH5α，长出克隆后进行PCR鉴定，鉴定阳性结果进行测序。

1.2.2重组慢病毒包装取对数生长期的293T细胞，按照每孔1.2×106个细胞接种。转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基，待细胞70%融合时分别将慢病毒表达载体质粒与pGC-GFP/Lentivirus质粒混匀，加入250 μL opti-MEM去血清培养液中，并用Lipofectamine2000共转染于相应的293T细胞组中。转染后48 h后可置于荧光显微镜下观察两组细GFP的表达情况，确定包装成功。72 h收集上清，3 000 r/min离心20 min，并经0.45 μm滤膜过滤后，将病毒上清于－80℃保存备用。

1.2.3病毒滴度测定孔稀释法测定病毒滴度。将病毒储存液按梯度稀释至10－4，依次取10 μL加到细胞中，放入37℃、5% CO2培养箱中培养。48 h后更换培养液，3～4 d后观察荧光表达。正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少，计数最大稀释倍数孔中的带有荧光的细胞个数。病毒滴度(TU/mL)=(荧光细胞个数×转染时细胞数/100×每孔加入病毒稀释液体积)×1/稀释浓度。

1.2.4重组慢病毒载体质粒转染人结肠癌细胞将人结肠癌多药耐药细胞分为2组:阴性重组慢病毒组对HCT-116/L-OHP进行阴性慢病毒Vector-Lentivirus转染; miR-200c重组慢病毒组对HCT-116/L-OHP结肠癌细胞转染miR-200c过表达重组慢病毒miR-200c-Lentivirus。转染前2 d以胰酶消化HCT-116/LOHP细胞，接种于24孔板，每孔计数(1～3)×105个细胞，当细胞长至50%的培养基面积时用于转染。将病毒原液稀释1×106溶于5 mL培养基，100 μL Lipofeetamine2000溶于5 mL培养基。混合后20 min，缓慢加入HCT-116/L-OHP细胞中。24 h后将培养液换为含血清的RPMI 1640培养基培养。感染48 h后，将培养板中的细胞按梯度稀释法比例接种，挑取克隆及扩增培养，并加入2 μg/mL的嘌呤霉素筛选，每隔3～5 d换液1次。当非荧光细胞几乎被完全杀死时，降低嘌呤霉素浓度，采用维持浓度(2 μg/mL)维持细胞的筛选。10 d后可见培养板底有细胞克隆形成，并作好标记。将标记好的阳性克隆用100 μL枪头进行挑取，移至仍为维持浓度的嘌呤霉素的完全培养液的24孔板中，继续扩增，消化、传代培养，冻存。建立HCT-116/L-OHP-luc细胞和HCT-116/LOHP-miR-200c-luc细胞两个稳定转染的细胞系。

1.2.5miR-200c mRNA检测方法采用实时荧光定量PCR法检测目的基因miR-200c mRNA表达。设计内参基因U6和目的基因miR-200c的引物和探针。miR-200c:上游引物为5'- ACACTCCAGCT-GGGTAATACTGCCGGGTAAT-3'，下游引物为5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCATCAT-3'; U6:上游引物为5'-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATAT-3'，下游引物为5'-AAAAATATGGAACGCTTCACGAA-3'。用RNAiso试剂分别提取细胞总RNA，并逆转成cDNA，按实时荧光定量PCR试剂盒说明进行荧光定量PCR反应。PCR反应体系(20 μL) : Premix EX TaqTM 10 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，荧光探针0.8 μL，dH2O 6 μL，cDNA 2 μL。反应条件: 94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，72℃退火10 min，共30个循环。数据采用ABI 7300 SDS Software分析。相对mRNA表达=2－ΔCt，ΔCt值=靶基因Ct值－GAPDH Ct值。

1.2.6裸鼠皮下移植瘤模型的建立方法取对数生长期的HCT-116/L-OHP、HCT-116/L-OHP-luc以及HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc细胞，以5×106/只数量接种于裸鼠腋下，每组接种6只。药物采用临床一线化疗常用药L-OHP，根据前期实验用药剂量经验。本实验采用5 mg/kg，0.2 mL/只，隔日1次。模型评价实验分为3组: HCT-116/L-OHP组、HCT-116/L-OHP-luc组和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc组。耐药实验分为4组: HCT-116/L-OHP-luc+生理盐水(NS)组、HCT-116/L-OHP-luc+ LOHP(5 mg/kg)组、HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ NS组和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ L-OHP(5 mg/kg)组，连续给药35 d。以颈椎脱臼法处死，剥离肿瘤组织，称重;并用游标卡尺测量肿瘤长、宽度，计算瘤体体积。

1.2.7实验动物活体成像的检测采用美国精诺真活体成像系统(IVIS 200)观测皮下肿瘤细胞的生长情况。观测前记录每只裸鼠体质量，根据荧光素底物注射浓度(150 mg/kg裸鼠体质量)，腹腔注射150 μL(30 mg/mL)荧光素底物，注射后10～25 min进行活体成像，IVIS 200曝光时间为5～10 s。每周1次，持续60 d。

1.2.8统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量数据以珋x±s表示，独立样本采用t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1重组慢病毒载体质粒滴度测定在本次滴度检测中，10－4μL样品中Ct值最高(ΔCt=18.695)，认为在10－4μL样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，根据病毒滴度计算公式，则病毒的滴度为2×108TU/mL。

2.2miR-200c mRNA相对表达经转染miR-200c-Lentivirus后，HCT-116/L-OHP细胞miR-200c mRNA相对表达量为13.12±1.41，空白对照组和转染空载体组分别为0.99±0.11和1.02±0.13; HCT-116/L-OHP细胞高于空白对照组和转染空载体组，P均＜0.01。

2.3裸鼠皮下移植瘤模型的建立及活体成像结果HCT-116/L-OHP细胞株接种后肿瘤体积随时间增加而增大，在观察期内无荧光素酶活性;而构建的稳定表达细胞株HCT-116/L-OHP-luc和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc在接种10 d后均有荧光素酶表达，随着接种天数的增加，荧光值逐渐增加，在第60天就已达到饱和。之后，肿瘤中心已出现坏死，中心荧光值降低，且HCT-116/L-OHP-luc组和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc组荧光值基本维持一致。见图1。

2.4各组瘤体大小比较给药35 d后，HCT-116/L-OHP-luc+ NS组、HCT-116/L-OHP-luc+ L-OHP组、HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ NS组和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ L-OHP组肿瘤体积分别为(998±90)、(500±80)、(980±80)、(300±30) mm3，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ L-OHP组小于HCT-116/L-OHP-luc+ L-OHP组，且均小于HCT-116/L-OHP-luc+ NS组和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ NS组，P均＜0.05。

3　讨论

肿瘤多药耐药是一种独特的广谱耐药现象，即一旦肿瘤细胞对一种化疗药产生耐药后，同时也对结构不同、作用机制不同的其他药物产生交叉耐药现象［7～9］。miRNA是近年来新发现的一类非编码小分子RNA，长度为22～28个核苷酸，广泛存在于真核生物细胞内，是最大的基因家族之一，占整个基因组的1%～4%［10］。其主要作用机制是与靶基因mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)特异性的碱基互补配对，结合到靶基因mRNA上，抑制靶基因mRNA翻译或直接使其降解，从而在转录后调控基因表达［11］。最新研究发现，耐药细胞中miR-200c参与了肿瘤耐药的发生［6，12］，但是具体机制尚不明确。

与传统的肿瘤动物模型相比，携带生物发光标记的基因动物模型，可以在活体内监测肿瘤的生长和转移、基因的表达、机体的生理病理改变过程以及进行药物的筛选。这种可视化模型堪称是动物模型检测监控领域的革命性进步。因此，国内外不少研究［13，14］已经采用GFP或者红色荧光蛋白这种特异性标记物来标记某种基因，再将该基因植入肿瘤细胞内，使肿瘤细胞成为发光源;然后接种动物体内，通过活体成像的方式及时监测活体生物体内的细胞活动和基因行为。但是，对于携带miRNA基因特异性标记物这方面的动物模型目前还未见文献报道。本研究通过构建miR-200c-GFP-Lentivirus以及对照慢病毒载体质粒，将其转染到人结肠癌HCT-116/LOHP细胞，筛选获得稳定表达miR-200c的HCT-116/L-OHP-GFP-Lentiviru细胞株。将携带miR-200c的HCT-116/L-OHP细胞接种于裸鼠皮下，成功建立了miR-200c过表达结肠癌耐药肿瘤模型，通过活体成像观察肿瘤的生长情况，达到更直观地评价药物对肿瘤的治疗作用。

我们的研究显示，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc稳转细胞株表现出和野生型HCT-116/L-OHP细胞以及HCT-116/L-OHP-luc稳转细胞株相似的体外生长和体内转移特性，提示它们的结肠癌耐药的生物学特性未受影响。通过活体成像荧光表达情况，发现在瘤体增殖的同时，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc与HCT-116/L-OHP-luc的荧光值基本保持一致，说明荧光值与瘤体的大小是呈正相关［8］。该发现与大部分采用荧光载体观测肿瘤的体内模型的研究结果一致［15，16］。体内研究发现，在裸鼠皮下移植瘤HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc模型中，miR-200c具有较强的抗化疗药物作用，与L-OHP联合使用，可有效抑制HCT-116/L-OHP结肠癌耐药细胞的增殖。

综上所述，本研究成功构建了稳定过表达miR-200c的人结肠癌多药耐药细胞系，利用该细胞株建立了裸鼠结肠癌移植瘤模型，证明miR-200c可有效地抑制肿瘤多药耐药的发生。通过分子和细胞水平进行成像，直观、活体、动态地连续观察肿瘤的生长转移情况，为肿瘤多药耐药的治疗和药物的筛选评价提供良好的技术平台。

参考文献:

［1］Sui H，Zhou S，Wang Y，et al.COX-2 contributes to P-glycoprotein-mediated multidrug resistance via phosphorylation of c-Jun at Ser63/73 in colorectal cancer［J］.Carcinogenesis，2011，32(5) : 667-675.

［2］Sui H，Fan ZZ，Li Q.Signal transduction pathways and transcriptional mechanisms of ABCB1/Pgp-mediated multiple drug resistance in human cancer cells［J］.J Int Med Res，2012，40(2) : 426-435.

［3］潘树芳，隋华，李琦，等.microRNAs调控消化系肿瘤多药耐药的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2013，21(19) : 1834-1840.

［4］Sui H，Zhu L，Deng W，et al.Epithelial-mesenchymal transition and drug resistance: Role，molecular mechanisms and therapeutic strategy［J］.Oncol Res Treat，2014，37(10) : 584-589.

［5］Lopes-Rodrigues V，Seca H，Sousa D，et al.The network of P-glycoprotein and microRNAs interactions［J］.Int J Cancer，2014，135(2) : 253-263.

［6］Chang L，Guo F，Wang Y，et al.MicroRNA-200c regulates the sensitivity of chemotherapy of gastric cancer SGC7901/DDP cells by directly targeting RhoE［J］.Pathol Oncol Res，2014，20(1) : 93-98.

［7］隋华，李琦.JNK/SAPK信号转导通路与多药耐药机制的研究［J］.肿瘤防治研究，2010，37(7) : 844-847.

［8］Amiri-Kordestani L，Basseville A，Kurdziel K，et al.Targeting MDR in breast and lung cancer: discriminating its potential importance from the failure of drug resistance reversal studies［J］.Drug Resist Updat，2012，15(1-2) : 50-61.

［9］Wu Q，Yang Z，Nie Y，et al.Multi-drug resistance in cancer chemotherapeutics: mechanisms and lab approaches［J］.Cancer Lett，2014，347(2) : 159-166.

［10］Cheng CJ，Bahal R，Babar IA，et al.MicroRNA silencing for cancer therapy targeted to the tumour microenvironment［J］.Nature，2015，518(7537) : 107-110.

［11］Hansen TB，Jensen TI，Clausen BH，et al.Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges［J］.Nature，2013，495(7441) : 384-388.

［12］Lobert S，Graichen ME.Regulation of tubulin expression by micro-RNAs: implications for drug resistance［J］.Methods Cell Biol，2013，115: 63-74.

［13］唐焱，周宏，钟警，等.PRMT2基因的miRNA载体构建及其活性鉴定［J］.中南医学科学杂志，2012，40(4) : 360-363.

［14］单志新，林秋雄，邓春玉，等.利用质粒介导的miRNA-1-2抑制H9C2中Hand2蛋白的表达［J］.南方医科大学学报，2008，28(9) : 1559-1567.

［15］刘卉卉，胡思怡，沈国栋，等.高表达HER2的自发转移性乳腺癌小鼠模型的建立与应用［J］.中国药理学通报，2014，30(11) : 1611-1615.

［16］Zhao JJ，Lin J，Zhu D，et al.miR-30-5p functions as a tumor suppressor and novel therapeutic tool by targeting the oncogenic Wnt/βcatenin/BCL9 pathway［J］.Cancer Res，2014，74(6) :1801-1813.

Construction of miR-200c gene recombinant lentiviral vector and establishment of multi-drug resistance animal models in human colon cancer

LIU Chong1，SUI Hua，ZHU Hui-rong，LI Dong，LI Qi
(1 Tongji Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200065，China)

Abstract:Objective To construct the lentiviral vector co-expressing human miR-200c gene and luciferase，and establish a stable colorectal cancer multidrug resistance(MDR) cell model，in order to lay an experiment foundation for exploring the function of miR-200c in MDR.Methods miR-200c gene was cloned into the lentiviral vector(pGC-Lentivirus)，which was verified by PCR and sequencing analysis.After sequencing，we made lentiviral vector and titer test.Using cell transfection technique，miR-200c lentiviral vector was infected into MDR cell line HCT-116/L-OHP.A nude mouse model of colorectal MDR cancer was established by subcutaneous inoculation of this kind of cell; meanwhile，the empty vector was taken as the control group.Experimental nude mice were randomly divided into 4 groups after 2-week tumorgrowth.Mice in the control group were administered with normal saline daily.Mice in the experiment group were administered with oxaliplatin(L-OHP).After treatment for 4 weeks，mice in each group were sacrificed to measure tumor volume.Results The best titer was 2×108TU/mL.The qPCR showed that the levels of miR-200c mRNA expression in the resistant cells of human colon cancer which were transfected by miR-200c-Lentivirus were significantly higher than those in the empty vector group and the blank control group(all P＜0.01).In vivo imaging confirmed that HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc cells with luciferase could be tested quickly and sensitively，and could be used to watch the tumor growth.Compared with HCT-116/L-OHP-luc group，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc group showed more sensitive to L-OHP(P＜book=11,ebook=2450.05).Conclusion The lentiviral screening vector with human miR-200c gene is successfully constructed，which realizes the stable integration of the recombinant in the human colon cancer HCT-116/L-OHP MDR cells; meanwhile，its MDR colon cancer animal models which have miR-200c overexpression with luciferase are successfully constructed.

Key words:colonic carcinoma; multidrug resistance; miRNA; lentiviral vector; animal model; in vivo imaging

(收稿日期:2015-01-28)

通信作者简介:李琦(1971-)，男，教授，曙光医院肿瘤科主任，主要研究方向为中西医结合肿瘤防治。E-mail: Lzwf@ hotmail.com

作者简介:第一刘冲(1985-)，男，主管技师，主要研究方向为临床检验诊断学。E-mail: lc2003lc2008@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81202812，81373862，81403360) ;上海市科技委员会资助项目(13140902500) ;上海市卫生局资助项目(2011ZJ030)。

文章编号:1002-266X(2015) 20-0010-04

文献标志码:A

中图分类号:R735.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.004