梗死区骨髓间充质干细胞注射对心肌梗死猪心脏结构形态及心功能的影响

解飞(西安医学院第二附属医院，西安710038)

梗死区骨髓间充质干细胞注射对心肌梗死猪心脏结构形态及心功能的影响

解飞
(西安医学院第二附属医院，西安710038)

摘要:目的观察心肌梗死猪梗死区骨髓间充质干细胞注射后心脏结构形态及心功能的变化，探讨同种异体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死猪的治疗作用。方法取21只健康成年家猪，其中1只用于分离其骨髓间充质干细胞，另外20只构建心肌梗死模型;于造模1 h后随机各选择10只分别于梗死区选择3点注射骨髓间充质干细胞(实验组)或生理盐水(对照组) 0.2 mL。饲养1个月，记录两组的存活情况，二维超声心动图观察两组动物的心脏结构形态及心功能。结果经鉴定实验获取的猪四肢骨单个核细胞为骨髓间充质干细胞。成功构建猪心肌梗死模型。细胞移植后1个月，实验组存活10只、对照组存活9只;二维超声心动图检查结果显示两组心脏结构无明显差异;实验组左室射血分数［(41.64±5.26) %］明显高于对照组［(36.73±4.32) %］(P＜0.05)。结论骨髓间充质干细胞移植可改善心肌梗死猪的心功能，但是对心脏结构影响较小。

关键词:心肌梗死;骨髓间充质干细胞;细胞移植;心脏功能;猪

由于心肌细胞是不可再生细胞，目前尚无使坏死心肌细胞再生的方法，也无法从根本上改善心功能［1］。干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的细胞，可向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等分化，且植入宿主后可长期存活［2～5］。干细胞同样具有分化为心肌细胞的能力，这为干细胞移植治疗心肌梗死提供了可能。2014 年2～8月，我们对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死猪的作用进行了观察。

1　材料与方法

1.1实验动物健康成年本地猪21只，4～5月龄，体质量28～32 (29.5±4.6) kg，由本院实验动物中心提供，经检验为健康合格实验用动物。

1.2猪骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定取实验动物1只给予氯胺酮腹腔注射麻醉，浓碘伏消毒。取猪四肢骨，去除干骺端，暴露骨髓腔，用10 mL培养液冲洗骨髓腔。将所获骨髓缓慢加入已含Ficoll-Paque分离液3 mL的试管内梯度离心(2 000 r/min、30 min)，吸取富含粒细胞中间界面层，PBS洗涤3次，制成单细胞悬液接种。培养条件为37℃、饱和湿度、5% CO2，培养基为DMEM(含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素)。3～4 d更换1次培养液，去除未贴壁细胞，至细胞融合时胰酶消化收集细胞、传代。收集第2代细胞，分别加入造血干细胞标志抗体FITC-CD34和FITC-CD45，间充质干细胞标志抗体PE-CD44、PE-CD29和PECD90，4℃冰箱中孵育30 min，流式细胞仪检测CD34、CD45、CD44、CD29、CD90。消化收集第3代骨髓间充质干细胞，改用成骨诱导培养液(高糖DMEM、10% FBS、地塞米松1×10－8mol/L、维生素C 50 mg/L、β-磷酸甘油钠10 mmol/L)，置于37℃、5% CO2的孵箱中培养，碱性磷酸酶染色检测其向成骨细胞分化情况。

1.3猪心肌梗死模型的制备及分组取20只实验动物术前禁食12 h，给予3%戊巴比妥钠溶液麻醉，穿刺股动脉，在动脉造影引导下，直接将球囊栓子推送并定位于靶血管区。采用冠状动脉血管造影及心电图监测模型的制备情况。将造模成功的20只猪随机分为实验组和对照组各10只。造模后1 h，实验组动物梗死区选择3点注射骨髓间充质干细胞0.2 mL，对照组注射生理盐水0.2 mL。

1.4心功能相关指标检测实验动物注射骨髓间充质干细胞或生理盐水后饲养1个月，应用二维超声心动图(标准左室长轴切面及心尖四腔心切面)观察两组动物心脏的结构形态及心功能(左室射血分数)。

1.5统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料用珋x±s表示，两组比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1骨髓间充质干细胞鉴定结果骨髓间充质干细胞培养24 h后少部分细胞开始伸展并贴壁生长，贴壁细胞呈梭形、三角形和多角形，为单个或多个细胞的克隆;培养7 d后细胞增殖迅速，可见集落生成，细胞折光性强。原代培养12～14 d，90%以上细胞融合，融合细胞呈梭形。流式细胞仪检测第2代细胞发现其不表达CD34、CD45，而表达CD29、CD44、CD90。经成骨诱导分化后，细胞碱性磷酸酶染色阳性，碱性磷酸酶活性部位呈棕黑色。证实分离培养的细胞是骨髓间充质干细胞。

2.2猪心肌梗死模型制备情况冠状动脉血管造影见猪冠状动脉供血区阻塞，同时心电图V1～V3或相关导联出现ST段弓背上抬及坏死性Q波，证实造模成功。

2.3骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死猪的治疗效果实验动物注射骨髓间充质干细胞或生理盐水后饲养1个月实验组均存活，对照组死亡1只。二维超声心动图检查结果显示两组动物心脏室壁均出现节段性收缩运动障碍，在梗死部位可见室壁运动消失，心肌无收缩，其周围心肌收缩力减弱，梗死部位与心电图诊断结果一致;两组心脏结构比较无明显差异。实验组左室射血分数(41.64±5.26) %、对照组为(36.73±4.32) %，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3　讨论

心肌梗死后，心肌细胞发生坏死、凋亡，数目减少，且无再生能力。因此，心肌细胞缺血坏死后只能由瘢痕替代，而瘢痕会加重心肌损伤，使正常心肌形成反常运动，导致心室结构发生改变，更易发生充血性心力衰竭，最终导致死亡［6］。干细胞具有自我更新能力，可向心肌细胞分化，对心肌梗死有一定的改善作用［7，8］。本实验采用栓子直接植入法成功建立猪急性心肌梗死模型［9］，采用密度梯度离心及贴壁法分离、纯化、培养猪骨髓间充质干细胞，将其直接由心外膜注射至心肌梗死区，发现其对心肌梗死猪心功能有明显的改善作用，与前人的研究结果相似。分析其原因可能为:①骨髓间充质干细胞在生理条件下能释放多种细胞因子、细胞活素等来调节基质重塑，减少瘢痕对心肌的损伤，增加梗死心脏的毛细血管密度，从而改善心功能，缩小梗死面积;②骨髓间充质干细胞可通过旁分泌作用间接诱导血管再生，恢复部分心肌的血供;③骨髓间充质干细胞在心脏微环境下分化为心肌样细胞，且其分化的心肌样细胞含微管、肌钙蛋白I和肌球蛋白重链，可与宿主细胞发生整合，改善心功能［10～12］。

有研究发现，骨髓间充质干细胞移植在梗死心肌内可存活6个月，并表达心肌细胞和内皮细胞特征性蛋白，但其对整体心脏功能的改善时间短暂，在术后4周时明显，到术后6个月时消失。本研究细胞移植后仅观察1个月，因此，有必要对骨髓间充质干细胞的长期疗效作进一步研究。

参考文献:

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·临床研究·

(收稿日期:2015-03-25)

文章编号:1002-266X(2015) 21-0028-02

文献标志码:A

中图分类号:R542.22

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.010