白藜芦醇与涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M增殖及凋亡的相关性研究

胡志伟 韩国良 张英怀 张威

>腺样囊性癌是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，肿瘤易沿神经扩散，浸润性极强，易侵及血管造成血行性转移，单纯放疗治疗效果差，常需要术后加以放疗，为提高患者生存率与生存质量，有必要寻求新的有效治疗方案。1998年Jang等［1］首次报道白藜芦醇具有抗癌活性，可对肿瘤产生抑制活性。本实验探讨白藜芦醇与涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M增殖及凋亡的相关性，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 高转移ACC-M涎腺腺样囊性癌细胞系(上海交通大学口腔医学院提供);白藜芦醇(中国药品生物制品检定所提供)。

1.2 方法

1.2.1 培养细胞:将RPMI1640的培养基加入到10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)中，并接种至50 ml培养瓶内，在37℃、5%CO2的恒温箱中饱和湿度培养，24～48 h传1代，使用0.04%二乙胺四乙酸二钠与0.25%胰蛋白酶(1∶1)混合液消化传代。

1.2.2 配制药液:将20 mg白藜芦醇溶于二甲基亚砜中制备成20 mg/ml的储存液备用，使用前再用培养液稀释。

1.2.3 进行MTT比色实验:取对数生长期细胞制备5 ×104ml的细胞悬液，接种到96 孔板中，每孔100 μl，待培养24 h后，将其加到白藜芦醇100 μl，使其终浓度各为12.5、25、50、100 和 200 μmol/L。设置不加药的对照组，每组设6个复孔。继续培养，待24、48、72 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl，将其培养4 h后吸去全部上清液，每孔加入200 μl的二甲基亚砜并振荡摇匀，将结晶完全溶解，置于酶标仪上测各孔的吸光度值(A)，按照公式:抑制率=(1－用药组平均A值/对照组平均A值)×100%计算生长抑制率。

1.2.4 倒置显微镜观察:观察培养瓶内实验组和对照组50 ml的细胞在不同培养时间的生存状况。

1.2.5 光镜观察:将细胞接种到6孔板内，孔内放置盖玻片，待爬片成功以后加入空白或含药的培养基，培养不同的时间后进行Giemsa染色，光镜观察细胞核形态。

1.2.6 检测细胞凋亡:用相同浓度的含药培养基处理细胞不同时间后或使用空白培养基、不同浓度的含药培养基处理后，使用Annexin-V-FITC与PI双标记活细胞，使用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。

1.3 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，吸光度值、生长抑制率及细胞凋亡率用SNK-q检验、相关分析及u检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT比色结果 白藜芦醇(100 μmol/L以上)可明显抑制ACC-M细胞。时间相同而浓度不同各组之间的OD值(药物浓度吸光度值)差异有统计学意义(P＜0.01)。浓度相同而时间不同各组之间的OD值差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1、2。

表1 白藜芦醇作用时间相同而浓度不同的6组之间OD值比较 ±s

表1 白藜芦醇作用时间相同而浓度不同的6组之间OD值比较 ±s

白藜芦醇浓度(μmol/L)24 h 48 h 72 h 0 12.5 25 50 100 200 0.251 ±0.016 0.244 ±0.006 0.243 ±0.017 0.238 ±0.042 0.236 ±0.020 0.058 ±0.015 0.289 ±0.022 0.269 ±0.036 0.249 ±0.026 0.247 ±0.040 0.239 ±0.031 0.057 ±0.021 0.462 ±0.030 0.374 ±0.060 0.353 ±0.049 0.351 ±0.025 0.346 ±0.094 0.018 ±0.004 P值0.005 0.000 0.000

表2 白藜芦醇浓度不同而作用时间相同的5组之间OD值比较 ±s

表2 白藜芦醇浓度不同而作用时间相同的5组之间OD值比较 ±s

白藜芦醇浓度(μmol/L) 24 h 48 h 72 h P值12.5 25 50 100 200 0.244 ±0.006 0.243 ±0.017 0.238 ±0.042 0.236 ±0.020 0.058 ±0.015 0.269 ±0.036 0.249 ±0.026 0.247 ±0.040 0.239 ±0.031 0.057 ±0.021 0.374 ±0.060 0.353 ±0.049 0.351 ±0.025 0.346 ±0.094 0.018 ±0.004 0.000 0.000 0.000 0.045 0.003

2.2 倒置显微镜观察 对照组:ACC-M细胞形态欠规则，成单层密集排列，胞浆、胞质丰富，圆形细胞核位于近中央处，细胞排列致密，可见部分细胞呈分裂增殖状。实验组:ACC-M细胞生长变慢，变小变少，细胞核呈深染较黑、胞浆、胞质浓缩，细胞之间连接较松懈。白藜芦醇浓度200 μmol/L作用72 h组可观察到细胞部分脱落，成悬浮状悬于培养液中，细胞生长近乎停滞，细胞皱缩，胞内颗粒变多，胞浆、胞核难以分辨，其余各个实验组与各个时间组与上述情况相同，只是没有白藜芦醇浓度200 μmol/L作用72 h组显著。见图1、2。

图1 倒置显微镜观察对照组ACC-M细胞(倒置显微镜×200)

图2 倒置显微镜观察实验组ACC-M细胞(倒置显微镜×200)

图 3 使用浓度分别为0 μmol/L(1)，12.5 μmol/L(2)，25 μmol/L(3)，50 μmol/L(4)，100 μmol/L(5)，200 μmol/L(6)的白藜芦醇处理ACC-M细胞72 h凋亡及坏死情况

2.3 流式细胞术检测 对照组ACC-M细胞属于自然凋亡，实验组ACC-M细胞凋亡率随浓度增大而升高、随时间延长而升高，且在100 μmol/L浓度以上时凋亡率明显升高，各时间组和浓度组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 3、4，见表3。

图4 200 μmol/L的白藜芦醇处理ACC-M细胞24、48及72 h凋亡及坏死情况

表3 流式细胞仪检测不同作用时间不同白藜芦醇浓度对各期ACC-M细胞凋亡率的关系 %

2.4 光镜观察 对照组:ACC-M细胞经Wright-Giemsa染色之后，可见ACC-M细胞的体积大，胞膜完整，胞浆也丰富，核浆比例大，胞核圆且大。用药组:可见ACCM细胞体积小，胞膜欠完整甚至出现破裂，胞核较小，核浆比例变小，细胞核深染，多数细胞核破碎，染色质严重浓缩，聚集于核膜周围，呈现为细胞凋亡。见图5、6。

图5 显微镜观察对照组ACC-M细胞(Giemsa染色×100)

图6 倒置显微镜观察实验组ACC-M细胞(Giemsa染色×100)

3 讨论

白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，是肿瘤的化学预防剂，也是对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂［2］。Jang等［1］首先报道白藜芦醇在癌症起始、增进和发展过程中，都有较大的防癌活性，且对癌症发生3个阶段都有抑制乃至逆转作用，而恶性肿瘤之所以发生就是因为细胞失去了对细胞增殖和凋亡的正常调控。白藜芦醇能够减少自由基形成，诱导Ⅱ期药代酶增多，拮抗二恶英，抑制环氧合酶，抑制过氧化氢酶，抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞分化、凋亡，而这正是其发挥抗肿瘤作用的重要机制。目前发现白藜芦醇对白血病［3］、乳腺癌［4］、鼠肝癌［5］等多种癌细胞具有明显抑制作用。结合本实验结果，我们认为白藜芦醇能够明显抑制腺样囊性癌ACC-M细胞，能够诱导ACC-M细胞坏死与凋亡。

通过MTT比色，可以反应出细胞增殖情况，细胞的吸光度和增值情况成正比关系，具有简单、快捷、误差小、外源性污染小等优点，多应用于肿瘤细胞药敏实验的研究［6］。OD值的大小与活细胞数量成正比。本实验表明:ACC-M的增殖能力与白藜芦醇的浓度和白藜芦醇的作用时间呈正相关性。当白藜芦醇浓度为200 μmol/L 时，24、48 和 72 h 的 OD 值 分 别 为(0.058±0.015)、(0.057 ± 0.021)和 (0.018 ±0.004)，差异有统计学意义。当白藜芦醇浓度为分别为 12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L，作用时间为72 h的 OD值分别为(0.374 ±0.060)、(0.353 ±0.049)、(0.351 ±0.025)、(0.346 ±0.094)和(0.018 ±0.004)，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明随着白藜芦醇浓度增加及作用时间的延长，细胞数目及活性明显降低，这和白藜芦醇对胶质瘤细胞A172杀伤作用具有时间-剂量依赖关系［7］的现象相似。

细胞-凋亡是细胞主动的死亡过程，其发生是受程序控制，逐步激活凋亡通路引起的，不产生炎症。而坏死由于细胞内含物释放到细胞外，导致炎症。白藜芦醇对ACC-M细胞系作用是通过凋亡还是坏死也是本实验关注点之一。使用倒置显微镜可以观察到实验组细胞增殖速率明显减慢，对照组细胞增殖速率明显较快，当白藜芦醇浓度为为200 μmol/L且作用时间为72 h，用倒置显微镜可以看到到部分正常ACC-M细胞出现变性坏死，此现象可能与白藜芦醇浓度过高时的毒性较高有关，也可能与ACC-M细胞正常的凋亡和其所处周围环境改变有关，而这也说明白藜芦醇可使ACC-M细胞坏死从而抑制其增殖。

本研究选择了光镜观察+流式细胞检测来观察白藜芦醇对ACC-M细胞系是否具有诱导凋亡的作用，通过光镜观察到了实验组ACC-M细胞出现了明显的凋亡形态:核碎裂、核固缩与核消失，这和贾志宇等认为的ACC-M细胞系凋亡和坏死途径可能存在交叉点，有某些共享的激酶或基因调控的观点［8］一致。流式细胞仪在检测细胞凋亡方面具有独特优势，Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，其与碘化丙啶联合使用，可以把凋亡早、晚期的细胞和死细胞区分。该实验结果说明白藜芦醇能明显加剧ACC-M细胞系晚期的凋亡。通过流式细胞检测了白藜芦醇对ACC-M凋亡的诱导作用，随着白藜芦醇对ACC-M作用时间的增加与作用时间的延长，凋亡细胞明显增加，实验数据整体的凋亡率与白藜芦醇浓度及对ACC-M作用时间是呈正相直线趋势，其最大凋亡率为92.6%，出现在白藜芦醇浓度为200 μmol/L并且作用72 h之时。

综上所述，本实验认为白藜芦醇对ACC-M细胞有较强的抑制作用和促进其坏死、凋亡的作用，用白藜芦醇来治疗腺样囊性癌将来有可能成为保守的药物治疗的一种方式，但其具体抗肿瘤的机制还需进一步研究。

1 Jang M，Pezzuto JM.Effects of resveratrol on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced oxidative events and gene expression in mouse skin.Cancer Lett，1998，134:81-89.

2 Frémont L.Biological effects of resveratrol.Life Sci，2000，66:663-673.

3 Horvath Z，Saiko P，Illmer C，et al.Resveratrol，an ingredient of wine，acts synergistically with Ara-C and tiazofurin in HL-60 human promyelocytic leukemia cells.Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids，2006，25:1019-1024.

4 Alkhalaf M.Resveratrol-induced growth inhibition in MDA-MB-231 breast cancer cells is associated with mitogen-activated protein kinase signaling and protein translation.Eur J Cancer Prev，2007，16:334-341.

5 Wu SL，Sun ZJ，Yu L，et al.Effect of resveratrol and in combination with 5-FU on murine liver cancer.World J Gastroentero，2004，10:3048-3052.

6 Morgan DM.Tetrazolium assay for cellular viability and activity.Methods Mol Biol，1998，79:179-183.

7 安梅，周瑾，陈晓宇.白藜芦醇药理学作用的研究进展.肿瘤药学，2014，4:242-246.

8 贾志宇，邸永宾，李晓玲，等.吴茱萸碱抑制涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M增殖的实验研究.实用口腔医学杂志，2012，28:592-596.