脂联素在2型糖尿病合并胆囊结石形成中的作用

王春城 暴雷 郭怀斌 张万星

脂联素是脂肪细胞分泌的一种特异性的蛋白，其生物学作用极其广泛，与许多临床疾病息息相关。有报道称脂联素在人类血液中的浓度一般在5～30 mg/L［1］，循环脂联素的浓度水平与人的肥胖程度、胰岛素抵抗(IR)现象及2型糖尿病具有较高正相关性，而与体重指数(BMI)和高胰岛素血症呈负相关［2］。肥胖的小鼠注射脂联素后，其IR出现减弱，且其血糖浓度有所降低［3］。这充分说明了体重的减少和脂联素浓度的增加正是提高胰岛素敏感性的有效方法，目前也有报道称脂联素可以改善糖尿病大血管病变情况［4］。研究发现，糖尿病患者中发生胆囊结石的几率非常高，糖尿病合并胆囊结石患者的血清胰岛素水平比非胆囊结石患者明显升高。并且，只要胰岛素水平出现持续轻度升高，不论性别或有无糖尿病病史，其胆囊结石的发生率均明显增高［5］。糖尿病患者的胆汁中胆固醇过饱和或者类脂的成份明显增加。由于胆囊收缩或者排空功能出现异常，导致过饱和的胆固醇胆汁发生淤滞、积蓄，从而促进胆囊结石的形成。因此，糖尿病在胆囊结石发病过程中具有非常重要的作用。有研究结果表明，胆囊胆固醇结石患者血清中的脂联素水平也非常的低。但是，糖尿病合并胆囊结石患者血清脂联素水平尚不明确，血清脂联素水平在糖尿病并发胆囊结石的过程中具有何种作用也未见相关报道。脂联素是否参与了糖尿病微血管病变的发生，并且对胆囊结石也有一定的影响有待进一步探讨。因此，本试验研究旨在通过检测2型糖尿病、2型糖尿病合并胆囊结石患者以及正常人群血清脂联素水平，并观察血清脂联素与患者的年龄、病程、体重指数(BMI)、糖化血红蛋白(HbA1c)的含量、血脂［三酰甘油(TG)、总胆固醇(CH)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)］含量水平的关系，以明确血清脂联素水平在2型糖尿病并发胆囊结石过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所有入选试验对象的年龄为31～64岁，中位年龄53岁。全部排除心、脑、肝、肾疾病。且3个月内未发生胆系以外的其他急性炎症病史。所有入选对象分3组:(1)从入院的2型糖尿病患者中选取单纯糖尿病患者(D组，29例);(2)糖尿病合并胆囊结石患者(D+G组，27例);(3)正常健康体检者(对照组，34例)。3组间年龄、性别比差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 入选标准 糖尿病:(1)具有典型症状，空腹血糖126 mg/dl(7.0 mmol/L)或餐后血糖≥200 mg/dl(11.1 mmol/L);(2)没有典型症状，仅空腹血糖126 mg/dl(7.0 mmol/L)或餐后血糖 200 mg/dl(11.1 mmol/L)应再重复1次，仍达以上值者，可以确诊为糖尿病;(3)没有典型症状，仅空腹血糖126 mg/dl(7.0 mmol/L)或餐后血糖 200 mg/dl(11.1 mmol/L)糖耐量试验2 h血糖200 mg/dl(11.1 mmol/L)者可以确诊为糖尿病。胆囊结石按以下标准入选试验:超声波或X线发现胆囊阳性结石即可入选。

1.3 方法

1.3.1 血液标本采集:所有受试对象均在禁食10～12 h后的试验日清晨空腹抽取肘静脉血3 ml，置于普通试管中，立即室温3 000 r/min离心10 min，分离血清，测HbA1c、血脂，其余血清分装保存在－80℃冰箱中，待标本收集完毕，同一批测定血清脂联素水平。

1.3.2 BMI计算:受试者清晨空腹排尿后，穿单衣、赤足、脱帽、站立位测身高、体重。身高值精确到0.1 cm;计重计上读取体质量;精确到0.01 kg。BMI=体重(kg)/身高2(m2)。

1.3.3 血脂分析:TG用GP-PAP法进行测定，CH用COD-PAP法进行测定，HDL用沉淀法进行测定，LDL值则通过Friedewald公式:LDL=CH-TG/2.2-HDL计算而来。采用BECKMAN全自动分析仪测定。

1.3.4 HbA1c:采用 USA Bio-Rad分光光度仪测定。

1.3.5 血清脂联素测定:采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)双抗体夹心法原理定量测定，试剂盒由美国Market公司提供，设置标准孔、对照孔与测定孔。为了确保测量结果的准确性，试剂的配制和操作步骤均严格按说明书进行，严格遵守酶标实验的基本要求。见表1。

表1 试剂盒组成成份

1.4 仪器及设备 见表2。

表2 仪器及设备

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA);脂联素与其他变量之间用多元线性回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂联素含量与OD值的关系 以标准品的浓度为横坐标(c)，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线，得到计算公式为 OD=0.2035c+0.0326(R2=0.9904)，将测定孔吸光度值代入，计算得脂联素浓度(c)。见图1。

图1 脂联素的标准曲线

2.2 3组检查指标结果 患者年龄、BMI 3组差异无统计学意义(P＞0.05)，D组与D+G组患者病程(Duration)差异无统计学意义(P＞0.05);D组及D+G组患者血清TG含量、血清中CH含量、LDL含量、HbA1c含量均高于对照组，而D组与D+G组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。D组及D+G组患者HDL的含量均低于对照组，且D+G组与D组比较进一步降低。见表1～3。

表1 3组年龄、BMI比较 ±s

表1 3组年龄、BMI比较 ±s

组别 年龄(岁) 病程(年) BMI(kg/m2)对照组(n=34)52.31 ±6.89 － 22.72 ±2.89 D 组(n=29) 51.63 ±6.63 7.63 ±2.63 24.17 ±3.13 D+G组(n=27)53.03 ±6.71 7.87 ±2.60 24.03 ±3.57

表2 3组TG、HDL、CH、LDL比较mmol/L，±s

表2 3组TG、HDL、CH、LDL比较mmol/L，±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与 D 组比较，#P ＜0.05

组别TG HDL CH LDL对照组(n=34)1.46 ±0.33 1.09 ±0.17 2.71 ±0.42 0.96 ± 0.19 D 组(n=29) 1.21 ±0.32* 1.21 ±0.28* 2.55 ±0.70 0.79 ±0.20 D+G 组(n=27) 2.98 ±0.43*#0.92 ±0.20*# 5.14 ±0.76*# 2.86 ±0.21*#

表3 3组HbA1c、脂联素比较 ±s

表3 3组HbA1c、脂联素比较 ±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与 D 组比较，#P ＜0.05

组别 HbA1c(%) 脂联素(mg/L)对照组(n=34)3.51 ±0.83 8.69 ±0.84 D 组(n=29) 9.00 ±1.30* 4.41 ±0.77*D+G 组(n=27) 9.65 ±1.38*# 3.86 ±0.64*#

2.3 3组血清脂联素结果比较 对照组血清脂联素水平明显高于D组(t=4.28，P＜0.05)及D+G组(t=4.83，P＜0.05);D组血清脂联素水平高于D+G组(t=0.54，P＜0.05)。见表3。单因素方差分析结果显示各组血清脂联素浓度之间差异有统计学意义(P＜0.01)。见表4。

表4 方差分析3组脂联素水平比较

2.4 单因素相关分析

2.4.1 血清中脂联素的含量与HDL的含量呈正相关(r=0.90)。见图2。

图2 HDL与血清脂联素的关系

2.4.2 血清中脂联素的含量与患者的BMI和HbA1c的百分比呈负相关 (相关系数分别为 －0.77和－0.72)。见图3、4。

图3 BMI和血清脂联素水平的关系

图4 HbA1c和血清脂联素水平的关系

2.4.3 血清中脂联素的含量与患者的年龄、患者的病程、血清中 TG、CH、LDL的含量均无相关性(P＞0.05)。

2.5 多元逐步相关分析表明 糖尿病合并胆囊结石患者血清脂联素的主要影响因素为患者的BMI、血清中HbA1c的百分比以及血清中HDL的含量。见表5。

表5 多元回归分析结果

3 讨论

胆囊结石的发病率近年来在我国呈逐步上升的趋势［6］。也有学者认为2型糖尿病患者一旦发生了IR和高胰岛素血症，发生胆囊结石的概率也会极大增加［7］。本试验结果发现，正常健康体检者的血清脂联素水平明显高于糖尿病非胆囊结石患者及糖尿病合并胆囊结石患者;糖尿病非胆囊结石患者血清脂联素水平高于糖尿病合并胆囊结石患者。因此，糖尿病合并胆囊结石患者血清脂联素水平处于较低水平，在糖尿病合并胆囊结石发病过程中具有重要作用。并且，糖尿病合并胆囊结石患者的BMI、血清中HbA1c的百分比以及血清中HDL的含量对血清脂联素水平的影响较大。

脂联素在血清中的分子质量大约为28 kDa，又称凝胶结合蛋白28，由白色脂肪组织合成和分泌。成熟后的脂联素蛋白包括:一个胶原样结构域、一个类似于补体C1q的结构域，分子之间形成三聚体的结构［2］。人类脂联素蛋白分子由244个氨基酸组成，一般以三种不同的形式存在:(1)2个三聚体组成低分子量的复合体;(2)6个三聚体组成高分子量的复合体;(3)三聚体聚合为球形。脂联素与细胞表面的脂联素受体结合而发挥作用，脂联素受体可分为两种亚型(Adipo 1、Adipo 2)，这两种受体亚型在人体内不同部位表达，脂联素受体1亚型主要在骨骼肌中表达，脂联素受体2亚型主要在肝脏表达。

研究显示，经过糖基化修饰后的脂联素在提高胰岛素敏感性中发挥了重要作用［8］。另外，脂联素还可以有效改善IR，IR程度决定着血清中脂联素的水平。研究显示，IR程度与血清中的脂联素水平成负相关关系［8］。并研究还发现胰岛素的增敏剂噻唑烷酮类药物可以显著提高普通人群、肥胖人群及2型糖尿病患者血清中的脂联素水平，其机制与激活脂联素启动子，以及抑制扭转肿瘤坏死因子α(TNF-α)的作用有较大的关系［9］。也有相关研究发现，脂联素在动物体外可以抑制TNF-α等相关炎性因子，以及其他一些黏附分子的表达;脂联素与炎性标志物C-反应蛋白之间呈负相关关系，在女性体内C-反应蛋白只要轻微地升高，其相应的血清中的脂联素水平就会马上降低。所以，脂联素还具有一定的抗炎作用［10］。

在2型糖尿病患者中，其IR与脂代谢的紊乱是同步发生的，并具有密切关系。其中脂代谢的紊乱主要是指血浆中游离脂肪酸以及TG脂的浓度水平升高，那么血清脂联素水平与血脂之间有何关系呢?正如胰岛素对脂代谢有促进作用一样，脂联素与此同时也参与了脂代谢的一系列的过程［11］。研究显示，血清中脂联素的浓度水平与TG脂呈明显的负相关性［12］。生理剂量范围内的脂联素能促进肝细胞内TG脂代谢的水平增加，能明显地降低肥胖小鼠和2型糖尿病小鼠血清中高脂血含量，并改善IR。而本试验研究结果却发现，血清中脂联素的含量与TG脂及胆固醇的含量之间并没有相关性，而与高密度脂蛋白的含量呈正相关，与上述研究结论不太相符合，分析可能原因:(1)部分患者试验前服用了降血脂类药物，并严格遵守了糖尿病饮食的原则，所以患者血脂水平虽与正常人有差别，但没有统计学意义;(2)由于试验时间的限制和病例采集的困难，本试验中样本量较小，一共只有90例，而两类的患者分别只有27例(糖尿病结合胆囊结石患者)和29例(单纯糖尿病患者)。

糖尿病患者还存在着严重的糖代谢紊乱。其主要临床特征之一就是血糖含量特别高。由于血糖受很多因素的影响，变化速率较快，例如饮食量、运动量以及是否服用降糖药物均可影响血糖浓度，使试验误差增大。而HbA1c的浓度可以反映出取血前的8～12周血糖的总水平，以弥补空腹血糖只能反映瞬时血糖值的不足，记忆血糖值的波动性。糖化血红蛋白的百分含量与血糖浓度呈正相关性，并且是不可逆的反应［13］。所以本试验研究选用此指标能更好地反映糖代谢的紊乱程度与血清脂联素浓度的关系。并且，本试验研究的结果也提示糖化血红蛋白HbA1c的百分含量与血清脂联素的浓度呈负相关性。

脂联素蛋白在脂肪细胞中的表达最为丰富，其基因编码的易感基因位点对于2型糖尿病和代谢综合征是非常敏感的，这说明脂联素与这些疾病存在着必然的联系。在脂蛋白代谢过程中，血清中脂联素的水平与血液中的血脂含量呈负相关性，例如脂蛋白颗粒、TG脂以及极低密度脂蛋白-载脂蛋白B的含量等［14］。在基础状态中，血清中低水平脂联素的浓度是预测将来患者患有2型糖尿病的预兆信号［15］。同样有研究结果表明，胆囊胆固醇结石患者血清中的脂联素水平也非常的低［16］。脂质及炎性因子的形成会被脂联素所抑制，脂联素不但能促进糖代谢过程，还能改善IR;它能加速脂肪酸的氧化，促进糖元的转运及降低肝糖元的输出，从而来增加胰岛素的敏感性，改善IR。

正常健康人BMI在18～24 kg/m2，肥胖者BMI一般都大于24 kg/m2，正常的健康人体内脂联素的水平比肥胖者要高。有研究发现，肥胖者经过一段时间的锻炼，减肥，其BMI会一定程度的下降，其体内脂联素的水平会有所回升［17］。本组实验在去除了其他影响因素之外，得出的结果与上述文献［17］结果一致，差异有显著性。另外，本实验研究入选的研究对象中，患者的糖尿病病程及年龄在各组间匹配一致，胆囊结石组和单纯糖尿病组患者的病程及年龄基本上没有差别，当去除其它原因后，没有发现血清中脂联素的水平与患者的病程及患者年龄之间存在任何的相关性，与国内外的研究结果也是一致的［18］。但是，对于它们之间的是否有无关系还有待进一步的研究确证。

以往研究发现，高密度脂蛋白的含量下降、低密度脂蛋白含量的升高、极低密度脂蛋白含量的升高是2型糖尿病并发胆囊结石的危险因素［19］。本研究提示，低血清脂联素水平也是2型糖尿病并发胆囊结石的一项高危险因素。首先，糖尿病患者血清中脂联素的含量减少，从而引起游离脂肪酸大量的堆积、积蓄，使患者体内的高密度脂蛋白分解代谢突然增高、加剧，低密度脂蛋白合成代谢大量增加，导致高密度脂蛋白/低密度脂蛋白比例失常［19］。并且，血清中脂联素水平的降低还会引起肝脏对胰岛素的敏感性急剧下降，继而引起血浆中游离脂肪酸浓度的上升［19］。

另一方面，由于进入肝脏的游离脂肪酸增多，刺激肝脏代谢，胆固醇和低密度脂蛋白在肝脏中产生增加，在IR的情况下，其又可引起脂蛋白脂酶活性降低、减弱，使低密度脂蛋白的降解非常缓慢，进一步导致低密度脂蛋白在血液中的含量缓慢升高，且使其转变为高密度脂蛋白的过程出现障碍，导致血液中高密度脂蛋白的浓度慢慢下降，从而使糖尿病患者的脂代谢过程发生异常，促使胆汁中的胆固醇呈过饱和状态，促进胆囊结石的形成［19］。血液中胆固醇的浓度较高时，可使胆汁中胆固醇浓度同样相应的升高，两者共同的作用使胆汁中的胆盐含量、胆固醇含量及卵磷酯的稳定三角关系被打破，从而易形成胆固醇结石。AMP活化蛋白激酶途径还可被脂联素激活，增加其磷酸化的程度，使其活性大大提高，引起下游一系列分子的改变［19］。

还有研究报道，脂联素可通过调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达调节胆囊慢性炎症过程，继而参与胆囊结石的形成［17］。脂联素还可通过调节TNF-α的表达刺激NF-κB在内皮细胞中的活性，继而激活炎症相关信号通路，从而导致炎性因子及黏附因子的表达大大增强［20］。脂联素的低表达还可能会引起糖尿病患者自主神经兴奋性增高，使其胆囊体积增大，出现胆囊排空障碍，以至于胆汁淤滞于胆囊，出现胆囊结石［21］。

综上所述，糖尿病合并胆囊结石患者的病死率比单纯糖尿病患者的病死率要高出2倍多［22］，糖尿病患者合并胆囊结石在临床上也是较为常见的情况，并且大多造成了严重的并发症。最近几年来，也有学者提出了一些糖尿病及其代谢综合征的治疗措施，例如上调血清中脂联素的水平浓度、上调脂联素受体表达、或者研制脂联素受体激动剂等方法［22］。本研究表明了血清脂联素水平与糖尿病易合并胆囊结石有关，与糖尿病胆囊结石患者的BMI、血清中HbA1c的百分比以及血清中高密度脂蛋白的含量有关，为糖尿病合并胆囊结石的发病机制及其病理基础提供了理论依据，为胆囊结石的临床治疗提供新的思路。总之，血清脂联素水平在糖尿病患者胆囊结石形成过程中具有重要作用。

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