上调miR-34c抑制胶质瘤细胞的迁移及侵袭

武震东 任洪波 孙志强 刘斌 牛国栋 焦保华

miRNAs是一种约22个核苷酸长度非编码单链小RNA，其本身不具有翻译蛋白质的功能，而是通过与mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)的碱基序列互补配对在转录后水平调控靶基因表达。miRNA与mRNA能进行完全或近乎完全的互补配对，诱导对mRNA的切割降解，而部分碱基配对则导致功能蛋白质的转录抑制［1］。最近有文章报道miRNAs与肿瘤的关系，特别是与肿瘤恶性度及肿瘤患者的预后有密切关系［2］。亦有报道与正常组织比较，恶性肿瘤组织的miRNAs异常表达［3］。一些miRNAs具有致瘤性，而另一些则具有抑制肿瘤发生的特性。致瘤性miRNAs在癌症中高表达，通过靶向肿瘤抑制基因等各种机制促进肿瘤的发生。相反，一些具有抑制肿瘤特性的miRNAs在癌症中低表达［4，5］。我们前期研究结果显示 miR-34c在胶质瘤组织中广泛表现为低表达，且随胶质瘤级别的升高，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达显著降低，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达与胶质瘤的级别存在显著负相关。本研究采用给胶质瘤细胞系U251和U87细胞转染 miR-34c-3p和 miR-34c-5p，上调其表达，检测miR-34c对人脑胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响，旨在为胶质瘤的治疗开拓新的思路。

1 资料与方法

1.1 细胞株 胶质瘤细胞系U251和U87细胞购于中国科学院细胞库。正常人胶质细胞系HEB购自中国科学院广州生物医药与健康研究院。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:U251用含10%FBS的 DMEM-F12培养基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培养基，将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内24～48 h后换液继续培养，换液的时间由细胞贴壁情况而定。培养U251、U87、HEB细胞达到指数生长期进行实验。

1.2.2 细胞转染microRNA:转染采用LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂，用LipofectamineTMRNAiMAX转染microRNA(mimics浓度为50 nmol/L)到细胞内，转染时使用Opti-MEM培养基，转染后4 h换为细胞生长培养基(U251用含10%FBS的DMEM-F12培养基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培养基)。

1.2.3 定量PCR检测转染效果:利用 Trizol(Invitrogen，USA)提取收集细胞总RNA。取1 μg总RNA做stem-loop引物的逆转录反应。miR-34c-3p和miR-34c-5p的共同逆转录引物为:miRNA R:5’CTCAACTGGTGTCGTGGA;PCR引物为:hsa-miR-34c-3p F:5’ACACTCCA GCTGGGAATCACTAACCACACGG;hsamiR-34c-5pF:5’ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTGAT;内参 U6的引物为:U6-F:5’CTC GCTTCGGCAGCACA;U6-R:5’AACGCTTCACGAATTTGCGT。所有引物均为上海生工合成。使用的定量PCR仪为ABI PRISM®7500 Sequence Detection System。PCR扩增程序如下:95℃变形5 min，随后95℃作用 15 s，65℃作用 15 s，72℃ 作用32 s，共进行 40 个循环，在温度60℃ ～95℃进行融解曲线分析，每个样本重复3次。

1.2.4 Transwell检测细胞迁移能力:细胞转染 miRNA第2天，计数1×105个细胞，用100 ml无血清培养基重悬(U251用DMEM-F12，U87用MEM培养基)，加入Transwell小室上室，在下室加入600 ml完全培养基。在37℃，5%CO2培养箱中孵育24、48 h，分别取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，结晶紫染色10 min，PBS洗涤3次，检测细胞是否穿过小孔，如有穿过终止其他实验组，在高倍镜下(×400)随机取5个视野计数，并拍照统计。重复实验2次。

1.2.5 Transwell检测细胞侵袭能力:4℃溶解Matrigel凝胶过夜，用预冷的无血清培养基(U251用DMEMF12，U87用DMEM高糖培养基)以1∶3的体积比稀释Matrigel凝胶，取40 ml加入预冷的Transwell板上室，覆盖整个聚碳脂膜，37℃孵育2 h使Matrigel凝胶凝固。细胞转染miRNA第2天，吸走小室中多余的液体，Transwell培养板上室加入100 μl细胞悬液(5×104个)并加入无血清培养基200 ml。Transwell培养板下室加入500 μl趋化因子，37℃，5%CO2培养24 h。用湿棉签轻轻擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。小心取出上室，用线拴住，并做好标记，用预冷的甲醇固定30 min。苏木素染色1 min。梯度乙醇脱水(80%，95%，100%)，二甲苯透明。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来，置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下(×400)随机取4个视野计数，取平均数。重复实验2次。

1.3 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，选用单因素χ2分析，如方差不齐采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 定量PCR检测miR-34c-3p和 miR-34c-5p的转染效果 在 U87和 U251细胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达量要明显小于正常胶质细胞系HEB。而转染了miR-34c-3p的U87和U251细胞，其miR-34c-3p的表达量明显高于未转染组的细胞(Normal组，P＜0.05)和NC 组细胞(P＜0.05)，miR-34c-5p也呈同样的变化。该结果确定了miRNA确实转染成功。见图1、2。

图1 转染miRNA-34c-3p前后，实时定量PCR检测正常胶质细胞系HEB、U251和U87细胞系中miRNA-34c-3p的表达;与 HEB比较，*P ＜0.05;与 Normal比较，#P ＜0.05;与 NC 组比较，△P ＜0.05

图2 转染miRNA-34c-5p前后，实时定量PCR检测正常胶质细胞系HEB、U251和U87细胞系中miRNA-34c-3p的表达;与 HEB比较，*P ＜0.05;与 Normal比较，#P ＜0.05;与 NC 组比较，△P ＜0.05

2.2 转染miRNA-34c抑制胶质瘤细胞的迁移能力利用 Transwell小室，U251细胞转染 miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其迁移至下室的细胞数量与Normal组和NC组相比显著减少，在U87细胞中的情况相同。见图 3、4。

图3 转染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，U251细胞的迁移情况;与Normal组比较，*P ＜0.05;与 NC 组比较，#P ＜0.05

图4 转染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，U87细胞的迁移情况;与Normal组比较，*P ＜0.05;与 NC 组比较，#P ＜0.05

2.3 转染miRNA-34c抑制胶质瘤细胞的侵袭能力

利用 Transwell小室，U251细胞转染 miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其侵袭至聚碳酯膜下表面的细胞数与Normal组和NC组相比显著减少，在U87细胞中的情况相同。该实验证实了miR-34c高表达能够抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。见图5、6。

图5 转染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，U251细胞的侵袭情况;与Normal组比较，*P ＜0.05;与 NC 组比较，#P ＜0.05

图6 转染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，U87细胞的侵袭情况;与Normal组比较，*P ＜0.05;与 NC 组比较，#P ＜0.05

3 讨论

肿瘤的发生是细胞增殖、凋亡和分化失衡的结果。越来越多的研究证实许多miRNA具有促进细胞增殖和存活的作用，同时还有许多miRNA具有抑制细胞增殖和存活的作用，这两类miRNA作为癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生发展过程中各自发挥着重要的作用。许多研究也说明将miRNA作为肿瘤治疗的靶标是可行的。在近期的研究中，miR-34异常表达抑制分化、克隆形成和细胞周期在 G1 期阻滞［6，7］。并且，miR-34a的再表达诱导了细胞的凋亡［8］。有证据表明miR-34介导的细胞凋亡能够被p53基因的失活所抑制。有报道 miR-34a靶向一些 mRNA，例如 SIRT1、Bcl-2、N-myc、cyclin D1，导致这些基因转录受到抑制［6，9，10］。

恶性胶质瘤是神经系统常见的肿瘤。通过前期的研究我们发现，与正常脑组织比较，miR-34c在人类恶性胶质瘤组织和多种细胞系中呈低表达。在本研究中，我们利用多种细胞生物学方法，进一步探讨miR-34c对胶质瘤U87和U251细胞系的生物学功能，以便为胶质瘤的治疗寻找新的靶标。我们利用脂质体介导的转染方法，将化学合成的miR-34c寡核苷酸转染到胶质瘤U87和U251细胞中，同时设立转染非特异性寡核苷酸片段的阴性对照组，使miR-34c基因有效的过表达。

本实验首先检测转基因细胞对胶质瘤细胞的迁移的影响。利用Transwell细胞迁移实验对细胞进行检测。我们发现，转染了miR-34c-3p或miR-34c-5p的细胞迁移能力明显减弱。我们进一步利用Transwell方法检测胶质瘤细胞侵袭能力，证实了miR-34c高表达能够抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。

从体外实验数据看来，miR-34c-3p和miR-34c-5p能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭，我们可以大胆推测miR-34c-3p和miR-34c-5p在胶质瘤中扮演抑癌的角色，但miR-34c-3p与miR-34c-5p是通过调控哪些基因起作用，目前还不明了，有待于在以后的实验中继续探讨。

1 Nelson KM，Weiss GJ.MicroRNAs and cancer:past，present，and potential future.Molecular cancer therapeutics，2008，7:3655-3660.

2 Gao H，Zhao H，Xiang W.Expression level of human miR-34a correlates with glioma grade and prognosis.Journal of neuro-oncology，2013，113:221-228.

3 Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.Nature reviews.Genetics，2009，10:704-714.

4 Deng S，Calin GA，Croce CM，et al.Mechanisms of microRNA deregulation in human cancer.Cell Cycle，2008，7:2643-2646.

5 Medina PP，Slack FJ.microRNAs and cancer:an overview.Cell Cycle，2008，7:2485-2492.

6 Bommer GT，Gerin I，Feng Y，et al.p53-mediated activation of miRNA34 candidate tumor-suppressor genes.Current biology，2007，17:1298-1307.

7 Tarasov V，Jung P，Verdoodt B，et al.Differential regulation of microRNAs by p53 revealed by massively parallel sequencing:miR-34a is a p53 target that induces apoptosis and G1-arrest.Cell Cycle，2007，6:1586-1593.

8 Hermeking H.The miR-34 family in cancer and apoptosis.Cell death and differentiation，2010，17:193-199.

9 Yamakuchi M，Ferlito M，Lowenstein CJ.miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105:13421-13426.

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