HDAC1及E2F1在肾透明细胞癌中的表达及意义

朱鑫 王亚轩 常学良 韩振伟 滕志海 王志胜 高栩 郭绍卫 李景东 黎玮

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，是泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于膀胱癌，肾透明细胞癌为肾癌中最为常见的病理类型，约占RCC 80%左右，近年来其发病率有上升的趋势［1］。因此，本研究以肾透明细胞癌患者为研究对象，通过观察组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及转录因子E2F1的表达，探讨二者与肾透明细胞癌临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年7月至2014年7月我科住院手术患者的肾透明细胞癌标本51例(经病理证实均为肾透明细胞癌)，同时选取24例癌旁组织(远离癌组织5 cm以上，均经病理证实为正常肾组织)。组织学分级按照WHO 1997年推荐的Fuhrman三级分类标准，临床分期按照2010年美国抗癌协会(AJCC)RCC的TNM分期标准。所有病例术前均未进行放疗、化疗和免疫治疗。所有标本分为两份，一份经10%甲醛溶液固定，常规石蜡块包埋、切片;另一份标本术后立即以液氮快速冷冻并保存于－80℃冰箱中备用。

1.2 实验试剂 兔HDAC1单克隆抗体及鼠E2F1单克隆抗体均购自于美国Santa Cruz生物技术公司，琼脂糖购自于西班牙公司，PCR反应体系、cDNA Synthesis Kit、RNAiso Plus、DL2000 DNA Marker均购自于日本Takara公司，ABC免疫组化试剂盒购自于美国Vector Laboratories公司。设立 GAPDH基因片段为HDAC1和E2F1基因表达的内参照;HDAC1基因上游引物:5＇-TGCAAAGAAGTCCGAGGCAT-3＇，下游引物:5＇-TGGCCTCATAGGACTCGTCA-3＇。E2F1 上 游 引 物:5 ＇-CTACGTGACGTGTCAGGACC-3 ＇，下 游 引 物:5 ＇-GGTGGGGAAAGGCTGATGAA-3 ＇。GAPDH 上 游 引 物:5 ＇-GACCACAGTCCATGCCATCA-3＇，下游引物:5＇-GAGATTCAGTGTGGTGGGGG-3＇。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学方法:采用免疫组织化学方法检测肾透明细胞癌组织、癌旁正常肾组织中HDAC1及E2F1的蛋白表达，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 RT-PCR 方法:用 Trizol加入 RNAiso Plus的溶液中提取组织总RNA，紫外分光光度计260、280和320 nm处读取OD值，然后测定RNA的纯度及含量。逆转录反应依照cDNA合成试剂盒说明书操作。将逆转录产物在基因扩增仪中进行PCR反应。将扩增产物放于含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker(DL2000)作为标准片段标记，电泳后经紫外透射仪观察、数码相机照相以及采用Quantity One凝胶图象分析软件对目的电泳条带分析后，以相应的内参电泳条带作为参照，最后采用两者积分吸光度比值表示结果。

1.3.3 结果评定:免疫组化结果判定方法:采用双评分半定量法进行评分，每张切片在高倍镜下随机观察10个视野(400倍)，每个视野均计数100个细胞，计算其平均阳性细胞百分比:无阳性细胞为0分;≤10%为1分;11% ～50%为2分;51% ～75%为2分;＞75%为4分。计数阳性细胞数染色强度分数标准:细胞未着色为0分;淡黄色为1分;黄色或淡棕黄色为2分;棕黄色为3分。将染色强度记分与染色细胞百分数计分相乘:0～3分为阴性表达;4～12分为阳性表达。

1.4 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果显示 HDAC1及E2F1的蛋白阳性表达均出现在细胞核。HDAC1蛋白在肾透明细胞癌组织中的阳性表达率为62.7%(32/51)，高于癌旁正常组织中的25%(6/24)(P＜0.05);E2F1蛋白在肾透明细胞癌组织中的阳性表达率为70.6%(36/51)，高于癌旁正常肾组织中的37.5%(9/24)(P＜0.05);HDAC1与E2F1的蛋白表达与患者性别、年龄及瘤体大小无关(P＞0.05);组织学分级及临床分期越高，蛋白表达阳性率越高(P＜0.05)。见表1、2，图1 ～4。

表1 肾癌、癌旁组织中HDAC1及E2F1的蛋白表达 例

表2 HDAC1及E2F1的蛋白表达与临床病理特征的关系

图1 癌旁正常组织中HDAC1的表达(IHC，SP×400)

图2 肾癌组织中HDAC1的表达(IHC，SP×400)

图3 癌旁正常组织中E2F1的表达(IHC，SP×400)

图4 肾癌组织中E2F1的表达(IHC，SP×400)

2.2 RT-PCR结果显示 HDAC1mRNA在肾透明细胞癌组织中的相对表达量为(0.35±0.15)，高于癌旁正常肾组织(0.10 ±0.04)(P＜0.05);E2F1mRNA 在肾透明细胞癌组织中的相对表达量为(0.32±0.09)，高于癌旁正常肾组织(0.14 ±0.03)(P＜0.05);HDAC1与E2F1 mRNA的相对表达量与患者性别、年龄及瘤体大小无关(P＞0.05);组织学分级及临床分期越高，mRNA相对表达量越高(P＜0.05)。见表3、4，图5。

表3 肾癌、癌旁组织中HDAC1及E2F1的mRNA相对表达量±s

表3 肾癌、癌旁组织中HDAC1及E2F1的mRNA相对表达量±s

类别 HDAC1 mRNA相对表达量 P值 E2F1 mRNA相对表达量 P值肾癌(n=51)0.35 ±0.15 0.000 0.32 ±0.09 0.004癌旁(n=24)0.10 ±0.04 0.000 0.14 ±0.03 0.004

表4 HDAC1及E2F1的mRNA相对表达量与临床病理特征的关系±s

表4 HDAC1及E2F1的mRNA相对表达量与临床病理特征的关系±s

组别 HDAC1 mRNA相对表达量 P值 E2F1 mRNA相对表达量 P值性别男(n=17) 0.379 ±0.036 0.539 0.305 ±0.055 0.283女(n=14) 0.333 ±0.068 0.539 0.327 ±0.038 0.283年龄(岁)＜60(n=13) 0.326 ±0.075 0.712 0.298 ±0.056 0.114≥60(n=18) 0.385 ±0.027 0.712 0.325 ±0.023 0.114瘤体大小(cm)≤7(n=19) 0.367 ±0.049 0.443 0.311 ±0.008 0.822＞7(n=12) 0.344 ±0.053 0.443 0.328 ±0.004 0.822组织学分级高、中分化(n=20)0.315 ±0.082 0.000 0.249 ±0.097 0.015低/未分化(n=11) 0.404 ±0.010 0.000 0.391 ±0.007 0.015临床分期Ⅰ +Ⅱ期(n=16) 0.299 ±0.083 0.012 0.278 ±0.094 0.008Ⅲ+Ⅳ期(n=15)0.395 ±0.002 0.012 0.359 ±0.015 0.008

图5 为HDAC1及E2F1在不同组织中mRNA的相对表达量(癌旁正常组织:1～6;肾癌组织:7～13)

3 讨论

肾透明细胞癌是泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤，严重威胁患者的生命健康。因此，深入探讨肾透明细胞癌发生发展的相关因素及分子机制，寻找新的分子生物学指标，为肾透明细胞癌的早期诊治寻找有效的诊断指标和治疗靶点。

HDAC1是Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶HDACs家族成员，其与组蛋白乙酰化酶(HATs)的共同催化，形成可逆的动态修饰过程，共同控制染色质中核心组蛋白的乙酰化水平;组蛋白的乙酰化程度与转录活性的发挥有密切关系。HDACs可以乙酰化不同种类的细胞转录因子或蛋白，影响多种抑癌蛋白或癌基因的表达，导致细胞的恶性增殖和肿瘤的发生［2］。目前发现HDAC1在前列腺癌、胃癌、结肠癌组织中高表达［3－5］。HDAC1与许多实体瘤的侵袭性及进展有密切关系，但在ccRCC中的表达报道甚少，Fritzsche等［6］研究了106例RCC及肿瘤旁组织中的HDAC1、2和3的表达，研究结果显示 60%的 RCC表达 HDAC1、2，而HDAC3只有13%的表达。Silvia等［7］研究发现人肿瘤细胞缺失HDAC1不能进行有效的有丝分裂，进而诱导细胞凋亡，细胞周期停滞在G1期或G2/M过渡期，从而抑制了肿瘤细胞的生长。

E2F1是细胞内一个重要的转录激活因子，参与细胞周期及细胞凋亡等众多的细胞活动调控过程，且与肿瘤的发生发展有密切关系。Xie等［8］的研究结果显示，利用E2F1质粒过表达后，胃癌细胞发生了细胞周期停滞现象，增殖抑制，凋亡增加，癌细胞侵袭能力受到抑制，提示E2F1抑制胃癌的发生发展，表明E2F1有抑癌的功能。而Yamasaki等［9］研究发现，E2F1基因缺失的Rb(+/－)小鼠的脑垂体和甲状腺肿瘤的发生率下降，提示E2F1又具有癌基因的功能。总之，转录因子E2F1在肿瘤发生发展中的促癌及抑癌作用至今没有统一及完整的阐述;但已经可以明确的是绝大多数肿瘤都存在基因突变或遗传修饰异常，最终导致E2F1的失活或活性加强。

本实验中，利用免疫组织化学法和RT-PCR法检测HDAC1及E2F1在蛋白及分子水平的表达，数据显示HDAC1与E2F1在肾透明细胞癌中的表达高于癌旁正常组织，且与组织学分级及临床分期有关，并随组织恶性程度的增加其表达水平逐渐增加，提示与肾透明细胞癌的进展有密切关系。通过检测HDAC1和E2F1在ccRCC中的表达可能对预测ccRCC的生物学行为以及早期诊断、制定治疗方案等方面有指导性的临床意义，并可能成为潜在的治疗靶点。但本实验也存在一些不足:(1)在细胞非分裂期的肿瘤细胞里抑制E2F1的活性发挥及表达，而进入分裂期，E2F1转录活性大大提高，促进恶性增殖，诱导肿瘤形成，而非分裂期与分裂期在临床实验中很难鉴定。(2)本实验未能进一步研究体外细胞株转染和进行动物模型实验，实验周期较短未能随访患者的远期预后情况，因此下一步需要增加这几方面的实验研究以完善本实验，并随访本研究中肾透明细胞癌患者的预后情况，分析HDCA1及E2F1的表达与患者预后的关系，进而明确HDCA1及E2F1能否用于对肾透明细胞癌患者预后的评估。

1 吴阶平主编.吴阶平泌尿外科学.第1版.济南:山东科学技术出版社，2008.889-912.

2 Cress WD，Seto E.Histone deacetylases，transcriptional control，and cancer.J Cell Physiol，2000，184:1-16.

3 Choi JH，Kwon HJ，Yoon BI，et al.Expression profile of histone deacetylase in gastric cancer tissues.Jpn J Cancer Res，2001，92:1300-1304.

4 Halkidou K，Gaughan L，Cook S，et al.Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer.Prostate，2004，59:177-89.

5 Patra SK，Patra A，Dahiya R.Histone deacetylase and DNA methyltransferase in human prostate cancer.Biochem Biophys Res Commun，2001，287:705-713.

6 Fritzsche FR，Weichert W，Rske A，et al.Histone deacetylases 1，2 and 3 are highly expressed in prostate cancer.Br J Cancer，2008，98:604-610.

7 Silvia S，Katrin Z，Simone M，et al.Role for histone deacetylase 1 in human tumor cell proliferation.Mol Cell Biol，2007，27:4784-4795.

8 Xie Y，Wang C，Li L，et al.Overexpression of E2F-1 inhibits progression of gastric cancer in vitro.Cell Biol Int，2009，33:640-649.

9 Yamasaki L，Bronson R，Williams BO，et al.Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/－ )mice.Nat Genet，1998，18:360-364.