SLA-Iα链和β链的原核表达与抗血清制备

刘 莹，杜吉革，盖新娜，周 磊，郭 鑫，杨汉春

(中国农业大学动物医学院 农业部动物流行病学与人兽共患病重点实验室，北京 100193)

SLA-Iα链和β链的原核表达与抗血清制备

刘 莹，杜吉革，盖新娜，周 磊，郭 鑫*，杨汉春*

(中国农业大学动物医学院 农业部动物流行病学与人兽共患病重点实验室，北京 100193)

猪主要组织相容性复合体I类分子又称猪白细胞抗原I类分子(SLA-I)，参与内源性抗原在体内的递呈过程，其结构包括重链(α链)和轻链(β链)两部分。本研究首先采用RT-PCR从原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增出SLA-I α链胞外区基因和β链基因；继而利用原核表达系统获得包涵体形式表达的SLA-I α链胞外区和β链重组蛋白质；将目的重组蛋白质洗涤、复性、纯化后，经Western blot及质谱技术进行验证。以纯化的重组蛋白质免疫兔制备抗血清，经间接ELISA检测其效价达1∶256 000。以制备的抗血清进行Western blot和间接免疫荧光试验，结果显示，所制备的抗血清能够特异性地识别原代及传代PAM表达的SLA-I α链及β链蛋白。研究结果不仅为SLA-I类分子的功能研究提供了有用的分析试剂，也为病毒感染的免疫机制研究奠定了必要的基础。

SLA-I α链；SLA-I β链；原核表达；抗血清

主要组织相容性复合物I类分子(the major histocompatibility complex class I，MHCI)在所有有核细胞及血小板的表面均有表达。MHCI分子由α链和β链(β2微球蛋白)构成。α链分为胞外区、跨膜区和胞质区三个部分，胞外区的功能区包括α1、α2、α3 三个结构域，其中α1和α2共同形成多肽结合槽；β链只有胞外区，通过非共价键与α3结合，以维持 MHCI分子天然构型的稳定性及其表达。MHCI分子参与内源性抗原的递呈过程，是机体细胞免疫应答过程中最重要的“桥梁”分子。在内质网上，α链在伴侣分子的作用下成熟，与β链组装成完整的MHCI分子[1]。MHCI分子结合适宜长度的内源性短肽，形成α链-β链-短肽复合物，经高尔基体分泌到细胞表面，发挥递呈抗原的功能，最终激活细胞毒性T细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)，诱导产生特异性细胞免疫应答，清除感染病毒[2]。

病毒在与宿主相互作用的过程中能够抑制感染细胞表面MHCI分子的表达，从而破坏宿主细胞的抗原递呈能力，抑制机体的细胞免疫应答。病毒利用其蛋白质抑制MHCI分子表达的途径各有不同，如腺病毒的E3蛋白、牛痘病毒的203蛋白通过结合MHCI分子造成其在内质网腔中的滞留[3-4]；而人巨细胞病毒的US2、US11蛋白及鼠巨细胞病毒gp48蛋白则通过使MHCI分子的α链降解来抑制MHCI分子表达[5-6]。

猪的MHC分子又称猪白细胞抗原(SLA)。SLA-I被认为是与猪免疫应答相关的最重要的基因之一[7]。已有研究报道，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)能够下调感染细胞表面SLA-I的表达[8-9]，但引起下调的具体机制尚不完全清楚。本研究制备的SLA-I α链和β链的抗体将为深入研究PRRSV等病原感染对以PAM为靶细胞的SLA-I表达调控以及免疫抑制的分子机制奠定必要的物质基础。

1 材料与方法

1.1 载体、菌株、实验动物与主要试剂

原代和传代PAM细胞、原核表达载体pET-21a(+)、pGEXT-6p-1由本实验室保存；新西兰兔购自北京芳元缘养殖场；TRIzol、SuperMixTaqDNA聚合酶、DNA琼脂糖胶回收试剂盒、pEASY-Blunt Cloning Vector、感受态细胞Top10、BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；M-MLV反转录酶、T4 DNA连接酶购自Promega公司；ECL显色液购自Vigorous生物技术有限公司；质粒DNA小量提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；包涵体复性试剂盒(Protein Refolding Kit)购自默克Novagen公司；可溶性TMB底物显色液购自Macgene公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；His标签抗体、GST标签抗体购自Abmart公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。

1.2 主要设备

TS-1型摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；ABI 7200型PCR仪(美国ABI公司)；PowerPac200型核酸水平电泳仪、PowerPac1000型蛋白质电泳仪、Gel DocTMXR+型凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；Centrifuge 5810R低温冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)。

1.3 引物设计

参照GenBank中SLA-1*0401(EU170457.1)基因序列设计SLA-Iα链胞外区引物[10]，参照L13854基因序列设计β链的扩增引物[11]，用于扩增原代PAM中SLA-I的α链胞外区基因、β链基因。根据测序结果设计α链胞外区和β链的原核表达引物，如表1所示。

1.4 SLA-I α链胞外区基因和β链基因的克隆与鉴定

用 TRIzol提取原代PAM细胞总RNA，参照M-MLV反转录酶使用说明书进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板分别用表1中的引物和Prime STAR®HS DNA Polymerase进行PCR扩增，扩增体系为50 μL。反应条件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。将回收的PCR产物与pEASY-Blunt载体连接后，转化Top10感受态细胞，挑选单菌落进行PCR鉴定，提取阳性菌落质粒送测序。两种阳性质粒分别命名为pEASY-Blunt-α和pEASY-Blunt-β，测得的序列用DNAMAN生物软件及在线数据库进行序列比对。

1.5 SLA-Iα链胞外区基因和β链基因原核表达重组质粒的构建

分别以质粒pEASY-Blunt-α和pEASY-Blunt-β为模板，用表1中的原核表达引物分别扩增SLA-I的α链胞外区基因和β链基因，α链胞外区PCR产物和pET-21a(+)载体经BamHI和XhoI双酶切后连接，β链PCR产物和pGEXT-6p-1载体经BamHI和XhoI双酶切后连接，均转化Top10感受态细胞。挑选单菌落进行PCR鉴定，提取阳性菌落质粒进行双酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送测序，命名为pET-21a-α、pGEXT-6p-1-β。

表1 SLA-I α链胞外区基因、β链基因的克隆引物及原核表达引物信息表

1.6 SLA-Iα链胞外区和β链的原核表达与纯化

将pET-21a-α、pGEXT-6p-1-β质粒分别转化BL21感受态细胞，IPTG诱导表达后，收集菌体，超声破碎后收集上清和沉淀，经12% SDS-PAGE检测重组蛋白质的表达及其可溶性。随后，对获得的两种重组蛋白质分别进行纯化与复性，SDS-PAGE检测纯化效果。BCA蛋白测定试剂盒测定纯化蛋白质的浓度。

1.7 SLA-Iα链胞外区和β链重组蛋白的鉴定

1.7.1 Western blot 纯化复性后的两种重组蛋白质经SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜(NC膜)上，分别以His标签抗体、GST标签抗体为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行孵育，用ECL显色液进行显色，最后在化学发光仪中曝光。同时以诱导表达的pET-21a(+)、pGEXT-6p-1空载体作阴性对照。

1.7.2 质谱鉴定 将纯化后的pET-21a-α、pGEXT-6p-1-β蛋白进行SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染色，切取对应的蛋白质条带，送上海启研生物科技有限公司进行质谱鉴定。

1.8 SLA-Iα链胞外区和β链抗血清的制备

1.8.1 抗血清的制备 将0.6 mg纯化的SLA-Iα链胞外区和β链重组蛋白分别免疫新西兰兔。首免时将蛋白溶液与弗氏完全佐剂等体积混匀，背部皮下多点注射。此后与等量的弗氏不完全佐剂混匀，免疫方法同前，每次免疫间隔两周。第三次免疫7～10 d后耳缘静脉采血，检测抗体效价，达标后进行加强免疫，一周后心脏采血，收集血清。

1.8.2 抗血清效价的测定 采用方阵法确定抗原的最佳包被浓度、阴阳血清的最佳稀释度，用最佳包被浓度的重组蛋白质包被ELISA反应板，4 ℃过夜；0.5% Tween-PBS洗涤3次后用5%脱脂乳37 ℃封闭2 h；充分洗涤后，加入倍比稀释的抗血清，同时以正常兔血清作为阴性对照(NC)。二抗为1∶10 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG。TMB显色后用2 mol· L-1H2SO4终止反应，测定OD450 nm值，以抗血清的OD450 nm与阴性对照OD450 nm值之比(P/N值)高于2时抗血清的最高稀释度判定为抗血清的效价。

1.9 抗血清在Western blot及间接免疫荧光试验(IFA)中的应用

1.9.1 Western blot分析SLA-Iα链及β链在PAM中的表达 收集原代PAM和传代PAM细胞蛋白，经SDS-PAGE电泳后转印至NC膜上。依次用制备的抗血清(1∶500稀释)和HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶10 000稀释)孵育NC膜。分析SLA-Iα链、β链在PAM中的表达，鉴定抗血清的反应性。

1.9.2 IFA分析SLA-Iα链及β链在PAM中的表达 将原代PAM和传代PAM细胞接种至铺有无菌玻片的24孔细胞培养板内，培养过夜。吸弃上清，用预冷的乙醇固定30 min；弃乙醇后，PBS洗涤。加入5% BSA或脱脂乳，37 ℃湿盒封闭1 h；PBS洗涤3次。加入1∶200阴性血清及制备的抗血清，37 ℃湿盒孵育2 h，PBS洗涤3次，每孔加入1∶200稀释的 TRITC标记的羊抗兔IgG，37 ℃湿盒避光孵育45～60 min，PBS洗涤3次。加入1∶1 000稀释的DAPI，室温5 min；PBS洗涤3次。最后将玻片取出，固定到滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

2 结 果

2.1 SLA-Iα链胞外区基因及β链基因的克隆与鉴定

琼脂糖凝胶电泳显示，扩增产物条带大小分别为825、357 bp左右，与预期结果相符，如图1所示。将测序结果Blast显示，扩增得到的SLA-Iα链胞外区核苷酸序列与SLA-1*0401胞外区相似性为96.2%，得到的β链核苷酸序列与L13854的相似性为99%。

M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1.α链胞外区RT-PCR产物；2.β链RT-PCR产物M.DL2000 DNA marker；1.RT-PCR product of α chain extracellular region；2.RT-PCR product of β chain图1 SLA-I α链胞外区基因及β链基因RT-PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR products of α chain extracellular region and β chain of SLA-I

2.2 SLA-Iα链胞外区、β链基因原核表达重组质粒的构建

用表1中所列的原核表达用引物进行PCR扩增，扩增片段酶切后分别克隆到pET-21a(+)、pGEXT-6p-1载体上。获得的重组质粒pET-21a-α、pGEXT-6p-1-β经双酶切后电泳观察得到片段的大小，如图2所示，酶切片段的大小与预期结果相符。

2.3 SLA-I α链胞外区和β链的原核表达与纯化

将重组表达质粒pET-21a-α 、pGEXT-6p-1-β以及空载体pET-21a、pGEXT-6p-1转化BL21并诱导表达。SDS-PAGE结果显示，表达的目的蛋白质相对分子质量分别为36和38 ku，大小与预计的重组蛋白质相对分子质量相符，两种重组蛋白质均以包涵体形式表达；按照Novagen®Protein Refolding Kit说明书对两种重组蛋白质进行纯化复性，结果见图3。

M.DL2000 plus DNA相对分子质量标准；1.pET-21a-α BamHI和XhoI双酶切鉴定；2.pGEXT-6p-1-β BamHI和XhoI双酶切鉴定M.DL2000 plus DNA marker；1.pET-21a-α digested with BamHIand XhoI；2.pGEXT-6p-1-β digested with BamHIand XhoI图2 原核表达重组质粒的酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids

A.α链胞外区的原核表达与纯化：M.蛋白质相对分子质量标准；1.pET-21a(+)诱导后；2.pET-21a-α诱导后上清；3.pET-21a-α诱导后沉淀；4.包涵体洗涤复性后。B.β链的原核表达与纯化：M.蛋白质相对分子质量标准；1.pGEXT-6p-1诱导后；2.pGEXT-6p-1-β诱导后上清；3.pGEXT-6p-1-β诱导后沉淀；4.包涵体洗涤复性后A.Recombinant expression of α chain extracellular region and purification：M.Protein molecular weight marker；1.pET-21a(+)induced with IPTG；2.The supernatant of pET-21a-α induced with IPTG；3.The inclusion bodies of pET-21a-α induced with IPTG；4.Protein of inclusion bodies after wash and refolding.B.Recombinant expression of β chain and purification：M.Protein molecular weight marker；1.pGEXT-6p-1 induced with IPTG；2.The supernatant of pGEXT-6p-1-β induced with IPTG；3.The inclusion bodies of pGEXT-6p-1-β induced with IPTG；4.Protein of inclusion bodies after wash and refolding图3 SLA-Iα链胞外区和β链的原核表达及其纯化Fig.3 Prokaryotic expression and purification of α chain extracellular region and β chain of SLA-I

2.4 SLA-Iα链胞外区和β链重组蛋白质的鉴定

2.4.1 重组蛋白质的Western blot鉴定 纯化的两种重组蛋白经SDS-PAGE后转移到NC膜上进行Western blot，结果见图4。带有His标签的α链胞外区重组蛋白及带有GST标签的β链重组蛋白和表达GST的pGEXT-6p-1空载体均出现特异性反应条带，大小与预期相符。

2.4.2 质谱鉴定 将纯化的 α链胞外区重组蛋白质与 β链重组蛋白进行质谱分析，结果显示，表达的重组蛋白质确是所要的目的蛋白质(图5)。

2.5 重组蛋白质抗血清效价的测定

经间接ELISA测定，以抗血清OD450 nm与阴性对照(NC)OD450 nm值之比高于2时抗血清的最高稀释度判定为抗血清的效价，结果如表2所示，制备的两种抗血清的效价均可达到1∶256 000。

2.6 抗血清在Western blot及IFA中的应用

2.6.1 Western blot鉴定PAM中表达的SLA-Iα链及β链 将原代PAM及传代PAM裂解后进行Western blot，结果如图6所示。已知SLA-I的α链相对分子质量约为45 ku，β链相对分子质量约为12 ku。从图中可以看出，两种细胞的裂解蛋白质在相应的位置均出现了特异性反应条带。表明所制备的抗血清能够特异性识别原代及传代PAM细胞表达的 SLA-Iα链和β链蛋白。

M.蛋白质相对分子质量标准；1.pET-21a(+)空载体诱导后；2.纯化后的α链胞外区重组蛋白；3.pGEXT-6p-1空载体诱导后；4.纯化后的β链重组蛋白M.Protein molecular weight marker；1.pET-21a(+)induced with IPTG；2.Recombinant α protein after purification；3.pGEXT-6p-1 induced with IPTG；4.Recombinant β protein after purification图4 SLA-I α链胞外区和β链重组蛋白的Western blot鉴定Fig.4 Western blot analysis of recombinant α chain extracellular region and β chain of SLA-I

A.α链胞外区重组蛋白质的质谱分析；B.β链重组蛋白质的质谱分析A.Mass spectrum analysis of recombinant α chain；B.Mass spectrum analysis of recombinant β chain图5 SLA-Iα链胞外区重组蛋白质与β链重组蛋白质的质谱鉴定Fig.5 Mass spectrum identification of recombinant α chain extracellular region and β chain of SLA-I

表2 不同稀释倍数抗血清测定的OD450 nm值

A.PAM表达的SLA-Iα链的Western blot鉴定；B.PAM表达的SLA-Iβ链的Western blot鉴定。M.蛋白质相对分子质量标准；1、3.原代PAM细胞蛋白；2、4.传代PAM细胞蛋白A.Western blot analysis of SLA-Iα chain in PAM；B.Western blot analysis of SLA-Iβ chain in PAM.M.Protein molecular weight marker；1，3.Proteins of PAM；2，4.Proteins of PAM cell line 3D4/21.图6 Western blot鉴定PAM中表达的SLA-I分子Fig.6 Western blot analysis of two chains of SLA-I in PAMs

2.6.2 IFA鉴定PAM表达的SLA-Iα链与β链 原代PAM及传代PAM分别加入一抗，再经二抗孵育、染核、制片后共聚焦成像，见图7、8。结果均显示阴性兔血清孵育的细胞无荧光信号，而制备的兔抗SLA-Iα链胞外区抗血清与兔抗SLA-Iβ链抗血清均能特异性识别原代PAM和传代PAM中的相应蛋白。

3 讨 论

SLA-Iα链与β链及抗原肽组成复合体，经过高尔基体加工后被递呈到细胞表面，在CD8等共受体分子的协助下，激活CTL免疫应答，抵抗病毒的入侵。而病毒在长期进化及宿主的免疫压力下，也获得了很多对抗宿主免疫的手段和机制，以确保其能够持续存活[12]。SLA-I作为猪抗病毒免疫应答的关键分子，病毒对其表达及其正常功能会进行多方面的干扰，以影响SLA-I对抗原分子肽段的有效递呈。已有研究表明，CSFV和PRRSV等病毒能够下调感染细胞SLA-I的表达，造成宿主细胞免疫应答水平的下降，是导致机体免疫抑制和病毒持续性感染的可能原因，但其具体机制还不清楚。本研究SLA-Iα链和β链抗体的制备为从分子组装角度解析病毒感染调控SLA-I的表达提供了有效工具。

作者根据SLA-1*0401、L13854基因序列设计引物分别从PAM中获得SLA-Iα链胞外区和β链基因，利用原核表达系统，获得SLA-Iα链胞外区蛋白和β链蛋白。并以纯化的重组蛋白质为免疫原制备抗血清，效价均达到1∶256 000，表明原核表达的重组蛋白质具有良好的免疫原性，可在兔体内产生高滴度的抗体。经Western blot 和IFA等检测，证明制备的兔抗血清特异性较好，能识别原代和传代PAM细胞表达的SLA-Iα链和β链蛋白。

A、A1、A2.DAPI染核；B、B1、B2.TRITC染色；C、C1、C2.叠加A-A2.DAPI；B-B2.TRITC；C-C2.The merging A-B，A1-B1 and A2-B2 respectively图7 间接免疫荧光鉴定原代PAM中表达的SLA-I分子Fig.7 Immunofluorescence identification of SLA-I in PAM with two antibodies obtained

D、D1、D2.DAPI染核；E、E1、E2.TRITC染色；F、F1、F2.叠加D-D2.DAPI；E-E2.TRITC；F-F2.The merging D-E，D1-E1 and D2-E2 respectively图8 间接免疫荧光鉴定传代PAM中表达的SLA-I分子Fig.8 Immunofluorescence identification of SLA-I in PAM cell line 3D4/21 with two antibodies obtained

在SLA-Iα链胞外区蛋白的表达过程中，最初构建的重组质粒经诱导后没有观察到目的蛋白的表达，即使改进诱导条件后表达量也很小。再一次进行序列分析发现，α链胞外区基因的5′端存在一些稀有密码子，可能不利于基因的表达。我们重新设计了表达引物，优化了5′端的其中2个密码子CCG(C)、CAT(C)。优化后构建的重组质粒经诱导后α链胞外区获得了较高丰度的表达。由此说明，在SLA-Iα链胞外区的原核表达过程中，序列5′端稀有密码子的存在限制了宿主细胞的识别，并进一步影响了目的蛋白的表达，而优化密码子不失为提高或改变目的基因在原核表达系统中表达效率的一个有效方法。

SLA-Iα链胞外区和β链的原核表达为后期单克隆抗体的制备奠定了基础，而抗血清的获得则为开展猪细胞免疫基础研究以及探究抗原递呈细胞表面SLA-I表达调控机制提供了有力工具。

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(编辑 白永平)

Prokaryotic Expression of SLA-I α Chain and β Chain and Antiserum Preparation

LIU Ying，DU Ji-ge，GE Xin-na，ZHOU Lei，GUO Xin*，YANG Han-chun*

(KeyLaboratoryofAnimalEpidemiologyandZoonosisoftheMinistryofAgriculture，CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

The swine major histocompatibility complex class I or swine leukocyte antigen class I (SLA-I)，made of the heavy chain (α chain) and light chain (β chain)，is involved in the process of endogenous antigen presenting.In the present study，we first amplified the genes of the extracellular region in SLA-Iα chain and β chain from porcine alveolar macrophage (PAM) using RT-PCR.The two genes were then cloned into the prokaryotic expression vectors and induced to express in the form of inclusion bodies.After being washed，refolded and purified，the recombinant proteins were confirmed by western blot and mass spectrometer.Then，the rabbit antiserum against the recombinant proteins was prepared with titers of 1：256 000 by an indirect ELISA.Finally，the antiserum was used in Western blot and indirect immunofluorescence assay，showing that the antiserum can specifically react with SLA-I α chain and β chain expressed in both PAM and PAM cell line 3D4/21.This study not only provides useful reagents for analyzing the function of SLA-I，but also develops the basis for further study on the mechanisms associated with immune responses induced by viral infections.

SLA-I α chain；SLA-I β chain；prokaryotic expression；antiserum

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.020

2014-10-13

教育部博导基金(20120008110039)；国家973项目(2014CB542701)

刘 莹(1989-)，女，江苏徐州人，硕士，主要从事动物病毒学与免疫学研究，E-mail：liuying8943@163.com

*通信作者：郭 鑫，教授，Tel：010-62731296，E-mail：guoxin@cau.edu.cn；杨汉春，教授，E-mail：yanghanchun1@cau.edu.cn

S852.4

A

0366-6964(2015)07-1224-08