LPS诱导条件下猪小肠上皮细胞TLR4及其信号通路基因表达变化分析

孙 丽，夏日炜，殷学梅，喻礼怀，朱国强，吴圣龙，包文斌*

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009；2.扬州大学兽医学院，扬州 225009)

LPS诱导条件下猪小肠上皮细胞TLR4及其信号通路基因表达变化分析

孙 丽1，夏日炜1，殷学梅1，喻礼怀1，朱国强2，吴圣龙1，包文斌1*

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009；2.扬州大学兽医学院，扬州 225009)

本试验通过0.1和1 μg·mL-1浓度的LPS诱导处理猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)，分别在2、4、6 h时利用实时荧光定量PCR方法检测TLR4及其信号通路相关基因(CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β和IFN-α)mRNA水平相对表达量，初步探讨猪小肠上皮细胞受到产肠毒素大肠杆菌侵扰发生炎症反应的相关分子反应机理。结果发现，两种浓度的LPS均使得所检测的TLR4及其信号通路相关基因表达量上调，诱导后4～6 h的表达量急速上升，且高浓度的LPS诱导处理后各基因表达量上调倍数明显高于低浓度LPS诱导时各基因表达量上调倍数，高浓度的LPS对机体肠道的刺激引起了更为强烈的免疫反应，使正常机体更快地产生炎症反应。由此推测，大肠杆菌侵染猪肠道后将释放LPS，TLR4作为LPS的受体，受LPS诱导其表达量上调，进而引起TLR4信号途径的信号传递，传递过程中由于MyD88的依赖机制，MyD88表达量上调相对稳定，再经过级联免疫放大效应，大量的促炎细胞因子释放，导致炎症及腹泻水肿病的产生。

猪；TLR4基因；信号通路；细胞因子

Toll样受体基因家族(Toll like receptors，TLRs)均属于I型跨膜蛋白受体，在机体组织细胞如胃肠道和呼吸道等组织中广泛分布，在机体防御病原体感染中发挥重要作用。在TLRs庞大家族中，TLR4是LPS识别的主要受体[1]。LPS对哺乳动物细胞的刺激除了TLR4参与外，需要多种蛋白的协同参与，如LPS结合蛋白(LPS binding protein，LBP)、白细胞分化抗原14(Cluster of differentiation antigen 14，CD14)、髓样分化蛋白-2(Myeloid differentiation protein 2，MD-2)等。其中，CD14是LPS的高亲和受体，存在LPS特异识别位点，LPS在LBP的促进作用下结合到CD14，从而CD14将其传递给TLR4受体复合物[2-3]。

目前发现，TLRs信号途径的接头蛋白有3种，分别为髓样分化因子(Myeloid differentiaion factor 88，MyD88)、TIR功能区的接头蛋白(TIR domain-containing adaptor protein，TIRAP或MyD88-adaptor-like，Mal)和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β，TRIF)。经过MyD88转导的信号途径称MyD88依赖途径(MyD88-dependent pathway)，其他则称作MyD88非依赖途径(MyD88-independent pathway)[4-5]，其分别经过一系列信号转导链，最后活化核转录因子(Nuclear factor κb，NF-κB)[6]，活化的NF-κB将信号迅速传至核内，增强TNF-α和IL-1β的基因转录，进一步激活核转录因子，使IL-6、IL-8等促炎性细胞因子和I型干扰素(IFN-α，IFN-β)的分泌释放增多，导致最初的炎症信号进一步放大，调控相关细胞因子表达，激活中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞，产生细胞因子级联放大效应，诱发炎症反应[7-8]。

产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)属于革兰阴性菌，可以引起断奶仔猪腹泻(Post-weaning diarrhea，PWD)和水肿病(Edema disease，ED)。ETEC首先黏附到小肠上皮细胞(Intestinal epithelial cell，IEC)并定居于特定肠段，大量繁殖后产生并释放的肠毒素(Enterotoxin)和内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)发挥病理效应[9]。本试验基于TLR4信号通路传递模式及其重要的生理功能，利用LPS诱导处理猪肠上皮细胞系(IPEC-J2)，检测TLR4及其信号通路相关基因(CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β、IFN-α)mRNA水平相对表达量，分析LPS诱导条件下TLR4及其信号通路基因的表达变化规律，探讨猪肠上皮细胞受到产肠毒素大肠杆菌侵染发生炎症反应的相关分子机理，为今后利用调控TLR4及其信号通路的表达水平来提升仔猪抗大肠杆菌侵染能力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及LPS处理

完全培养液(DMEM培养基与F12培养基1∶1混合，含10%胎牛血清；DMEM培养基、F12培养基和胎牛血清均购自Gibco BRL，Life Technologies，Grand island，NY，USA)培养猪小肠上皮细胞系IPEC-J2(由美国宾夕法尼亚大学惠赠)，长至80%～90%汇合时，用不同浓度(0.1和 1 μg·mL-1)的LPS(Sigma-aldrich，St.Louis，MO，USA)进行诱导，阴性对照组只加用于配置诱导液的细胞培养液，每组有3个平行样。分别在诱导后的2、4、6 h提取细胞RNA。阴性对照组在培养后的6 h提取细胞总RNA。

1.2 反转录及Real-time PCR

按照反转录试剂盒(PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time，TaKaRa，大连，中国)操作程序进行反转录，cDNA合成：每10 μL的反应体系中含5×PrimerScript RT Enzyme Mix 2 μL，总RNA不超过500 ng，RNase-free ddH2O补足至10 μL。反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

以cDNA为模板，对基因(TLR4、CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β、IFN-α)表达量进行检测分析，各基因检测引物见表1，由生工生物工程有限公司(上海，中国)合成。使用实时荧光定量PCR试剂盒(PrimeScriptTMRT Master Mix Perfect Real Time，TaKaRa，大连，中国)，反应体系：10 μL SYBR Premix ExTapTMII(2×)，0.4 μL PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)，0.4 μL PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)，0.4 μL ROX Reference Dye II(50×)，2 μL cDNA，ddH2O补至20 μL。ABI 7500 系统进行实时荧光定量反应的检测。Real-time PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环；为分析扩增产物的特异性，PCR扩增结束后采集多个信息点进行熔解曲线分析，程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。

表1 各基因荧光定量引物

1.3 数据处理与统计分析

基因相对定量的结果采用2-ΔΔCt法进行计算，用内参基因GAPDH对各基因表达水平进行均一化，2-ΔΔCt法计算公式：ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔΔCt =试验组ΔCt值-参照组ΔCt值[10]。利用 SPSS 16.0 软件的一般线性模型(General Linear Model，GLM)对各不同处理时间的细胞基因表达差异情况进行比较分析。

2 结 果

2.1 LPS诱导IPEC-J2后不同时间的TLR4信号通路基因表达量差异

设每个基因阴性对照的表达量为1，对TLR4信号通路基因的荧光定量结果进行统计，在0.1 μg·mL-1的LPS诱导后各个基因表达量呈阶梯状增长，如图1。在LPS诱导后的2 h，各基因表达量都有所升高，但差异均不显著。诱导后的4 h，除IFN-α外，其余基因表达量都显著或极显著高于阴性对照组，其中TLR4和IL-1β的表达量极显著高于诱导后2 h的表达量(P<0.01)。诱导6 h后，除TLR4基因，其余基因的表达量都极显著高于阴性对照和诱导后2、4 h的表达量(P<0.01)。

1.0 μg·mL-1的LPS刺激小肠上皮细胞后各基因的表达量在4～6 h急速上升。TLR4和IFN-α的表达量在诱导后的4 h极显著高于阴性对照组和诱导后2 h试验组(P<0.01)。在LPS诱导后的6 h，所测通路基因的表达量都与其他组差异极显著(P<0.01)。同时与0.1 μg·mL-1的LPS相比，所有通路基因的表达水平都大幅度上升(图2)。

2.2 LPS诱导IPEC-J2后TLR4信号通路不同基因表达量升高倍数的差异

由图3可知，在0.1 μg·mL-1的LPS诱导后的2 h，TLR4的表达量上调倍数最高；诱导后4 h，TNF-α上调倍数最高，其次为IL-1β，均极显著高于CD14、TLR4、MyD88和IFN-α(P<0.01)；在诱导后的6 h，IL-1β的表达量上调倍数最高，其次为TNF-α，且同样均极显著高于CD14、TLR4、MyD88(P<0.01)，显著高于IFN-α(P<0.05)；IFN-α上调倍数显著增加，极显著高于MyD88(P<0.01)，显著高于TLR4(P<0.05)。

NC.阴性对照。*.P<0.05；**.P<0.01。下图同NC.Represents negative control.*.P<0.05；**.P<0.01.The same as below图1 0.1 μg·mL-1 LPS诱导IPEC-J2后TLR4信号通路基因的表达量Fig.1 Genes expression of TLR4 pathway in IPEC-J2 induced by 0.1 μg·mL-1 LPS

图2 1.0 μg·mL-1 LPS诱导IPEC-J2后TLR4信号通路基因的表达量Fig.2 Genes expression of TLR4 pathway in IPEC-J2 induced by 1.0 μg·mL-1 LPS

图3 0.1 μg·mL-1 LPS诱导后TLR4信号通路基因的表达量比较Fig.3 The comparison of expression among the genes of TLR4 pathway induced by 0.1 μg·mL-1 LPS

由图4可知，在1.0 μg·mL-1LPS诱导后的2 h，TNF-α的表达量上调倍数最高；在诱导后的4 h，IFN-α的表达量上调倍数最高，其次为TNF-α，均极显著高于CD14、TLR4、MyD88和IL-1β(P<0.01)；IL-1β的表达量上调倍数显著高于CD14(P<0.05)，且极显著高于MyD88(P<0.01)；在诱导后的6 h，IFN-α的表达量上调倍数仍保持最高，其次为IL-1β，极显著高于CD14、TLR4、MyD88和TNF-α；IL-1β的表达量上调倍数急剧增加，其次为TNF-α(P<0.05)，且极显著高于CD14、TLR4和MyD88(P<0.01)，TNF-α的表达量上调倍数极显著高于CD14、TLR4和MyD88上调趋势依次从高到低。

图4 1.0 μg·mL-1 LPS诱导后TLR4信号通路基因的表达量比较Fig.4 The comparison of expression among the genes of TLR4 pathway induced by 1.0 μg·mL-1 LPS

3 讨 论

TLR4是天然免疫系统中的跨膜受体，可非特异性与病原相关分子结合，接受LPS等多种炎症信号启动机体炎症反应。MyD88是TLR4信号通路中的一个关键接头分子，与NF-κB构成炎症反应通路，TLR4通路在传递炎症信号和增强炎症强度，引发肠道炎症介质的释放中具有重要的作用[11]。小肠上皮细胞是猪抵抗肠道致病菌的第一道防线，是与革兰阴性菌的LPS直接作用的细胞，它的病变将会导致仔猪的腹泻和水肿等症状的出现。本试验用LPS体外诱导IPEC-J2，结果TLR4信号通路的基因及其效应因子的表达量都随诱导时间的推移而显著上调，而且在诱导后的6 h都与阴性对照呈极显著差异(P<0.01)。这与相关研究结果类似，LPS的刺激会引起猪小肠上皮细胞内细胞因子的表达上调[12]，LPS免疫应激可以上调母兔TLR4、IL-1β和IL-6在下丘脑中以及IL-1β和IL-6在卵巢、输卵管中的表达量[13]，M.Moue等的研究也表明，LPS诱导后肠上皮细胞内TLR4的表达量显著上调[14]。相关研究均说明了TLR4的基因上调是促使炎症产生的关键。本研究用猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)来研究LPS与宿主的相互作用，可以在细胞水平探讨TLR4信号通路对于仔猪大肠杆菌疾病的抗性调控机制，进一步证明，TLR4免疫通路受LPS诱导激活，并在长时间作用下使此免疫通路信号不断增强，提示在猪体内TLR4及其信号通路参与了LPS感染并引起症状的过程。

细胞因子是由免疫原、丝裂原或其他因子刺激细胞所产生的低分子量可溶性蛋白质，为生物信息分子，具有调节固有免疫和适应性免疫应答，促进造血，以及刺激细胞活化、增殖和分化等功能[15]。TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放，诱导MHCⅡ类抗原在结肠上皮中的表达[16]。同时，TNF-α还可诱导结肠上皮细胞凋亡，促进溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)的发生。IL-1β可以增强细胞免疫和体液免疫介导的组织损伤过程，趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位，引起一系列肠道炎症反应和组织破坏。丁伟群等发现IL-1β在溃疡性结肠炎患者受累肠黏膜上显著升高，未受累黏膜IL-1β也明显高于正常组，说明IL-1β确实参与UC的发生发展过程[17]。IFN-α可促进大多数细胞MHCI类抗原的表达，活化NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞，引起机体的免疫反应，起到抗病毒作用，来维持机体正常水平[18]。本研究结果显示，LPS诱导后的4 h开始，细胞免疫因子TNF-α、IL-1β和IFN-α的mRNA表达量上调的倍数都显著或极显著高于其他基因。可见，LPS先是诱导膜蛋白CD14和TLR4的mRNA表达，再通过依赖MyD88或非依赖MyD88的信号途径传递，最终导致细胞因子的mRNA成放大倍数的增长，这也很好的体现了细胞免疫的级联放大机制。推测机体内的免疫效应就是通过此级联瀑布效应来应激LPS所介导肠道内致病性细菌的附着和侵染，进而导致肠道内炎症的产生及仔猪的腹泻和水肿等症状的出现。用两种浓度的LPS来诱导IPEC-J2，1.0 μg·mL-1浓度的LPS刺激后使TLR4信号通路各基因mRNA的表达量明显高于0.1 μg·mL-1浓度LPS诱导时各基因mRNA的表达量。由此推测，相对较高浓度的LPS对机体肠部的刺激会带来更强烈的免疫反应，使正常机体更快速的产生炎症反应，以致仔猪严重的腹泻和水肿。M.Moue等的研究表明，0.25 μg·mL-1的LPS会引起肠上皮细胞TLR4 mRNA的表达显著上调(P<0.05)，而0.025或5 μg·mL-1浓度的LPS均未引起TLR4 mRNA的显著上调[14]。本试验所选择LPS浓度恰好在这两者之间，所得试验结果与其相互补充。另外，无论是0.1 μg·mL-1或是1.0 μg·mL-1浓度的LPS来诱导小肠上皮细胞，MyD88基因表达的增长倍数都为最低，这可能与此通路对MyD88的依赖性有关，MyD88 mRNA水平的表达量表现为相对稳定，以此来确保机体的代谢稳定。

已有研究表明，TLR4基因的表达水平往往与各种炎症反应相关，H.Hammad等发现，吸入屋尘螨提取物后，呼吸道上皮细胞表达的TLR4 能够活化树突状细胞导致过敏性炎症[19]；E.Cario研究发现肠炎病人TLR4表达上调[20]。本课题组前期研究表明，TLR4基因表达水平的下调可以提高断奶仔猪对于F18大肠杆菌的抗性[21]；本试验结果进一步证实了TLR4及其信号通路基因表达水平对于猪大肠杆菌抗性存在调控作用，提示，下一步在继续深入研究TLR4信号通路对于猪大肠杆菌抗性调控机理的基础上，可以考虑利用RNAi等手段，系统研究下调和干扰TLR4及其信号通路的表达是否可以提升仔猪对于大肠杆菌侵染能力，为猪大肠杆菌病的抗病育种工作提供新的方法和策略。

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(编辑 郭云雁)

本刊相关报道(以下文章由本刊网站www.xmsyxb.com可以免费下载查阅)：

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Analysis of Differential Expression ofTLR4 and TLR4 Signaling Pathway Genes under Lipopolysaccharide-induced Pig Intestinal Epithelial Cells

SUN Li1，XIA Ri-wei1，YIN Xue-mei1，YU Li-huai1，ZHU Guo-qiang2，WU Sheng-long1，BAO Wen-bin1*

(1.KeyLaboratoryforAnimalGenetics，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

In this study，we exposed pig intestinal epithelial cells (IPEC-J2) to 0.1 and 1 μg·mL-1LPS for 2，4 and 6 h，respectively.Then，we estimated the relative mRNA expression ofTLR4 and TLR4 signaling pathway-related genes (CD14，MyD88，TNF-α，IL-1β，IFNα) using qPCR，which preliminary revealed the mechanism of the molecules related to inflammatory reactions in pig intestinal epithelial cells induced by enterotoxigenicEscherichiacoli.Both concentrations of LPS upregulated the expression ofTLR4 and its signaling pathway-related genes，and the expression level of all genes sharply increased from 4 to 6 h.The fold change of mRNA expression induced by 1.0 μg·mL-1LPS was significantly higher than that induced by 0.1 μg·mL-1LPS.The former stimulated the intestinal tract to produce stronger immune responses and more rapid development of inflammatory reactions.Above results suggested that LPS was released in the pig intestinal tract withE.coliinfection，and upregulated the LPS receptor TLR4，leading to activation of the TLR4 signaling pathway.Given the dependency on myeloid differentiation factor 88 (MyD88) during signaling，stable upregulation ofMyD88 and the cytokine cascade results in the release of large amounts of proinflammatory cytokines，causing inflammatory reactions，diarrhea and edema disease.

swine；TLR4 gene；signaling pathway；cytokines

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.003

2014-09-28

国家自然科学基金(31372285；31172183)；江苏省高校自然科学研究重大项目(14KJA230003)；转基因生物新品种培育科技重大专项(2014ZX08006-001B)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

孙 丽(1992-)，女，江苏如皋人，硕士生，主要从事猪遗传育种研究，E-mail：sl19920327@163.com

*通信作者：包文斌，博士，研究员，主要从事猪抗病育种研究，E-mail：wbbao@yzu.edu.cn

S828.2

A

0366-6964(2015)07-1095-07