NGF对支气管哮喘大鼠气道重塑影响及其机制

范春辉，程兆忠，韩伟忠，王燕

(青岛大学附属医院呼吸内科，山东 青岛 266003)



NGF对支气管哮喘大鼠气道重塑影响及其机制

范春辉，程兆忠，韩伟忠，王燕

(青岛大学附属医院呼吸内科，山东 青岛 266003)

目的 研究神经生长因子(NGF)在支气管哮喘气道重塑中的作用及其可能机制，为哮喘治疗寻求新的靶点。方法 将30只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组、哮喘模型组和NGF抗体干预组。苏木精-伊红染色观察大鼠气道壁组织学改变，Masson染色观察气道上皮下胶原层厚度，免疫组化法检测肺组织血管内皮生长因子(VEGF)、Ⅲ型胶原表达。结果 哮喘模型组及NGF抗体干预组支气管壁厚度、支气管平滑肌厚度、支气管平滑肌细胞核数、支气管壁血管密度、上皮下胶原层厚度、VEGF及Ⅲ型胶原的表达较对照组显著增加，NGF抗体干预组以上改变较哮喘模型组减轻，差异均有统计学意义(F=108.29～554.21，P<0.01)。大鼠支气管壁血管密度和管壁厚度与肺组织中VEGF蛋白表达，气道胶原层厚度与Ⅲ型胶原含量均呈正相关(r=0.82～0.87，P<0.05)。结论 NGF可能通过调控肺组织VEGF、Ⅲ型胶原的表达参与哮喘气道重塑。

哮喘；神经生长因子；气道重塑；血管内皮生长因子A；胶原Ⅲ型

近年来大量研究表明，慢性哮喘病人即使在临床缓解期仍持续存在肺功能的异常,存在一定程度不可逆的气流阻塞，即气道重塑[1]。气道重塑目前被认为是哮喘慢性化、持续化及严重化的病理基础，治疗哮喘必须与防治气道重塑相结合，才可能达到真正意义上的控制。糖皮质激素是目前公认的最有效的治疗哮喘的药物，但它是否可直接或通过减轻炎症间接抑制或逆转气道重塑，目前仍存在争议，所以探寻新的缓解气道重塑的药物对于哮喘的控制具有重要意义[2]。有研究表明，神经生长因子(NGF)与哮喘气道炎症、高反应性和气道重塑密切相关[3]。体外实验结果证明，NGF可引起皮肤血管的增生和重建,而血管内皮生长因子(VEGF)可作为新生血管形成及重建的重要指标[4-5]。胶原是气道壁的重要组成部分。因此，本实验通过阻断哮喘模型大鼠NGF，研究NGF与哮喘气道重塑及VEGF、Ⅲ型胶原表达的关系，探讨NGF是否参与哮喘气道重塑及其可能机制。

1 材料与方法

1.1动物分组及处理

SPF级健康雄性Wistar大鼠30只，鼠龄7周龄，体质量(200±20)g (青岛市药检所动物实验中心提供)。随机分为3组。①哮喘模型组(哮喘组)：第1、8天大鼠腹腔注射新鲜配制的鸡卵清蛋白(OVA)溶液2 mL(内含OVA 100 mg、氢氧化铝100 mg)致敏，第15天起将大鼠置于半封闭玻璃箱内雾化吸入10 g/L的OVA 10 mL激发哮喘，隔日1次，每次30 min，共6周。②对照组：操作同哮喘组，但以生理盐水代替过敏原腹腔注射及雾化。③NGF抗体干预组(干预组)：模型建立同哮喘组，于第6次雾化激发起，激发前3 h，先经鼻滴入兔抗大鼠NGFβ抗体(1∶50稀释，购于武汉博士德生物公司)50 μL。

1.2标本采集

最后一次激发后24 h内，腹腔注射100 g/L水合氯醛3.5 mL/kg麻醉大鼠，心脏穿刺放血处死。即刻打开胸腔，自肺门处分离左肺，生理盐水快速冲洗，取左肺下叶肺组织，置于中性甲醛固定液中固定24 h，转入体积分数0.70乙醇溶液中，24 h内送病理科行石蜡包埋、切片，厚度为4 μm，分别用于苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组化方法检测肺组织VEGF和Ⅲ型胶原的表达。

1.3标本组织学检测

①气道形态学观察：苏木精-伊红染色病理切片在光学显微镜(100倍)下找到完整的无软骨中小支气管横断面，每张切片均随机选取上、中、下3个视野，采用英吉尔数码医学图像分析系统进行图像采集，使用Image-Pro Plus图文分析软件对染色标本分别测量支气管基底膜周径(Pbm)、总管壁面积(WAt)、支气管平滑肌面积(WAm)、支气管平滑肌细胞核数(N)，将测得的WAt、WAm、N使用Pbm进行标准化。②气道血管形态学观察：每个标本观察5张切片，显微镜(100倍)下于黏膜下层、黏膜固有层血管多的区域选10个视野，计数50个视野(1 mm2)中管腔样结构的总数作为血管密度。③上皮下胶原：采用Masson染色进行观察，随机选取直径500～1 000 μm结构完整的支气管横断面3个，测定上皮下胶原面积(Wcol)，并用Pbm进行标准化，代表气道胶原层的厚度。④肺组织VEGF和Ⅲ型胶原：采用免疫组织化学方法检测，以平均吸光度(A)表示。

1.4统计学处理

2 结 果

2.1哮喘发作情况

对照组大鼠吸入生理盐水后无明显反应；哮喘组和干预组大鼠在第1次雾化吸入OVA后，大部分哮喘发作(多在激发后30 min发作)，表现为呼吸频率加深加快，口唇发绀，腹部翕动，肋间隙凹陷，四肢无力，行动迟缓，俯伏不动，烦躁不安，大小便失禁等；干预组雾化吸入OVA后，哮喘症状逐渐减轻，第4次应用抗体后已无明显反应。

2.2肺组织病理学变化

对照组大鼠支气管黏膜上皮、黏膜肌层、肺组织结构完整，支气管管腔规则，无明显炎症细胞浸润。与对照组比较，哮喘组大鼠支气管管腔狭窄，支气管上皮可见大量杯状细胞，平滑肌及基底膜明显增厚，大量胶原沉积，肺泡间隔明显增厚，气道壁及肺泡间隔可见淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及浆细胞为主的炎症细胞浸润。与哮喘组比较，干预组大鼠上述改变明显减轻。

2.3图像分析

2.3.1各组大鼠气道形态学指标比较 在支气管壁厚度(WAt/Pbm)、支气管壁平滑肌厚度(WAm/Pbm)及支气管壁平滑肌细胞核数量(N/Pbm)3个指标上，哮喘组及干预组均显著高于对照组,而干预组较哮喘组则明显下降，差异均有统计学意义(F=273.62～554.21，P<0.05)。见表1。

2.3.2各组大鼠气道血管密度的比较 哮喘组及干预组的气道血管密度均明显高于对照组，干预组气道血管密度则明显低于哮喘组，差异均有统计学意义(F=108.29，P<0.05)。见表2。

2.3.3各组大鼠上皮下胶原层厚度(Wcol/Pbm)的比较 哮喘组及干预组大鼠上皮下胶原沉积较对照组明显增多，干预组上皮下胶原沉积较哮喘组明显减少，差异均有统计学意义(F=142.29，P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠气道形态学指标测定

表2 各组大鼠气道血管密度及Wcol/Pbm的比较

2.3.4VEGF在大鼠肺组织中表达情况 VEGF阳性染色为棕黄色或棕褐色颗粒，主要定位于胞浆。与对照组比较，哮喘组及干预组大鼠肺组织VEGF蛋白表达显著增加，干预组大鼠VEGF蛋白表达与哮喘组比较明显减少，差异均有统计学意义(F=243.81，P<0.05)。见表3。

2.3.5Ⅲ型胶原在大鼠肺组织中的表达情况 Ⅲ型胶原阳性染色为棕黄色。哮喘组及干预组大鼠肺组织Ⅲ型胶原表达显著高于对照组，干预组大鼠Ⅲ型胶原表达显著低于哮喘组，差异均有统计学意义(F=399.25，P<0.05)。见表3。

2.4相关性分析

大鼠气道血管密度和管壁厚度与肺组织VEGF蛋白的表达，气道胶原层厚度与Ⅲ型胶原含量均呈正相关(r=0.82～0.87，P<0.05)。

组别nVEGFⅢ型胶原对照组100.11±0.040.17±0.04模型组100.33±0.040.43±0.04干预组100.21±0.040.32±0.03

3 讨 论

气道重塑是哮喘除慢性炎症性改变之外的又一特征性病理变化，包括气道平滑肌增生、肥大，上皮细胞增生，上皮下纤维化，细胞间质重构和血管分布增多等[6-7]。本实验成功复制了大鼠哮喘气道重塑模型，病理组织学观察显示，与对照组相比，模型组大鼠出现了明显的气道重塑的改变，包括气道壁增厚，气道平滑肌细胞数量增多、肥大，气道壁血管增生，上皮下胶原沉积量明显增加等。

NGF是神经营养因子家族的一员，最初因其可促进神经元细胞的存活和分化而被发现[8]。除了神经保护作用外，有越来越多的证据支持NGF在修复机制中发挥作用。有研究结果显示，哮喘病人体内NGF水平显著高于正常人，且与病情严重程度呈正相关[9]。而与气道重塑密切相关的支气管上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞均可表达NGF，而且自身有NGF受体[10]。因此，推测NGF可能在哮喘气道重塑中亦起一定的作用。本文结果显示，阻断NGF活性后，大鼠气道壁增厚程度、气道平滑肌厚度及细胞数目、气道血管密度及上皮下胶原沉积厚度均较模型组明显减轻，表明NGF可能通过某种机制参与哮喘气道重塑。

有研究显示，应用卵蛋白反复激发的致敏大鼠，血清中VEGF水平与气道血管计数、血管平滑肌厚度及血管渗透指数呈正相关[5]。本文结果显示，模型组肺组织VEGF表达及气道血管密度均较对照组明显升高，肺组织VEGF表达与气道血管密度及气道壁厚度均呈正相关，此结果进一步证明VEGF产生增加可能通过某种机制促进气道血管生成从而参与气道重塑。在既往的体外实验中已证明，NGF可引起皮肤血管的增生和重建[4]。而本研究结果显示，应用NGF抗体干预后，大鼠肺组织VEGF表达及气道血管密度较模型组均显著下降，提示在哮喘发病过程中，NGF可能通过某种机制促进VEGF的释放，进而促进气道血管生成增加，从而促进哮喘气道重塑。其具体机制及相关的信号转导通路尚待进一步研究。

哮喘病人气道上皮下胶原纤维层的密度和厚度均比正常增加，因此气道壁发生形变时的阻力相应增加，从而对抗平滑肌的收缩和使气道缩窄，最终导致气道强直。因此有学者提出，气道壁胶原的增多可以作为气道重塑的标志物之一[11]。研究显示，增厚的气道基底膜主要由Ⅲ、Ⅴ型胶原、少量Ⅰ型胶原及纤维连接蛋白组成，组织纤维化过程中早期以Ⅲ型胶原为主[12]。本研究中，模型组较对照组Ⅲ型胶原含量及气道胶原层厚度均显著增加，而且气道胶原层厚度与Ⅲ型胶原含量呈显著正相关。表明Ⅲ型胶原可作为气道胶原沉积及气道重塑的敏感指标。NGF干预后大鼠气道胶原层厚度及Ⅲ型胶原含量较模型组显著下降，提示NGF可能通过促进Ⅲ型胶原的合成导致气道胶原沉积增加，进而促进哮喘气道重塑。已有研究结果表明，NGF可诱导肺纤维母细胞迁移及分化成肌成纤维细胞，也能够诱导其产生胶原[13]。且既往研究报道肺成纤维细胞表面有NGF受体表达[10]。因此，推测肺成纤维细胞可能为NGF作用的靶细胞，NGF引起肺成纤维细胞分泌胶原的具体机制尚待进一步研究证实。

气道重塑是一种不可逆的病理改变，是难治性哮喘的病理基础。因此，研发新的防治哮喘气道重塑的药物具有重要的临床意义。本研究及国内外的许多研究均证明，NGF与哮喘气道重塑密切相关。然而，NGF及其受体的信号转导通路，NGF与其他细胞因子、炎症递质的相互作用机制尚不明确。研发安全有效的NGF阻断剂用于哮喘的防治成为一个具有重大临床意义的设想，有待于进一步研究。

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(本文编辑 马伟平)

EFFECT OF NERVE GROWTH FACTOR ON THE AIRWAY REMODELING OF ASTHMA RATS AND ITS MECHANISMS

FANChunhui,CHENGZhaozhong,HANWeizhong,WANYan

(Department of Respirology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo study the effect of nerve growth factor (NGF) on the airway remodeling of asthma and its possible mechanisms, and explore new targets for its therapy.MethodsThirty healthy maleWistarrats were divided into normal group, the asthma model group and NGF-antibody group at random. HE staining was used to observe the histological changes of the airway, Masson staining to estimate the thickness of epithelium collagen, and immunohistochemistry to measure the levels of VEGF and collagen Ⅲ.ResultsThe thickness of the bronchial wall and the bronchial smooth muscle (BSM), the number of the BSM cells, the vascular density of the bronchial wall, the thickness of epithelium collagen, the levels of VEGF and collagen Ⅲ in the asthma model group and the NGF-antibody group increased versus the control group, and the above changes in the NGF-antibody group were lighter than the asthma model group, the differences being significant (F=108.29-554.21,P<0.01). The density of the bronchial vessels and the thickness of the wall were positively correlated with VEGF expression in the lung tissue, the thickness of the bronchial wall and the level of collagen Ⅲ (r=0.82-0.87,P<0.05).ConclusionNerve growth factor is likely involved in airway remodeling of asthma rats by regulating the expressions of VEGF and collagen Ⅲ in lung tissue.

asthma; nerve growth factor; airway remodeling; vascular endothelial growth factor A; collagen type Ⅲ

2014-01-15;

2014-05-14

范春辉 (1987-)，女，硕士研究生。

程兆忠(1963-)，男，硕士，教授，硕士生导师。

R562.25

A

1008-0341(2015)02-0173-04