甲状腺及乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因mRNA表达及其启动子甲基化状态分析

于进堂，刁力，李君平，徐世晨

(青岛大学医学院附属医院海阳分院内分泌科，山东 海阳 265100)



甲状腺及乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因mRNA表达及其启动子甲基化状态分析

于进堂，刁力，李君平，徐世晨

(青岛大学医学院附属医院海阳分院内分泌科，山东 海阳 265100)

目的 探讨甲状腺、乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因mRNA表达及其启动子的甲基化状态。方法 采用RT-PCR及甲基化特异性PCR(MSP)方法检测33例甲状腺、乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因mRNA表达及其启动子甲基化状态，以30例单纯甲状腺乳头状癌和20例甲状腺良性病变组织作为对照。结果 多原发癌病人甲状腺癌组织、单纯甲状腺乳头状癌组织和甲状腺良性病变组织WIF-1基因的表达缺失率分别为51.5%(17/33)、36.7%(11/30)、15.0%(3/20)，3组比较差异有统计学意义(χ2=7.105，P<0.05)。多原发癌病人甲状腺癌组织、单纯甲状腺乳头状癌组织WIF-1基因的甲基化率分别为45%(15/33)、43%(13/30)，高于甲状腺良性病变组织的10%(2/20)，差异有显著性(χ2=6.349、7.185，P<0.01),但多原发癌病人甲状腺癌组织与单纯甲状腺乳头状癌组织相比差异无显著性(P>0.05)。结论 WIF-1基因mRNA表达缺失在甲状腺、乳房多原发癌的发生过程中起关键作用；WIF-1基因启动子区的高甲基化状态可能是其mRNA低表达的机制之一。

肿瘤,多原发性；甲状腺肿瘤；乳房肿瘤；WIF-1；DNA甲基化

多原发癌是指同一器官或不同器官同时或先后发生两种或两种以上的原发性恶性肿瘤。导致多原发癌的原因是多方面的，其中宿主易感性与肿瘤的发生有着密切的关系，抑癌基因的突变可导致原癌基因变成致癌基因，引起癌细胞的生长繁殖。很多研究趋向于多原发癌源于相同的致癌基因，而抑癌基因启动子区高甲基化状态是沉默抑癌基因的重要表观遗传学机制，可促进肿瘤的发生和发展，成为目前抑癌基因的研究热点之一[1-2]。抑癌基因WIF-1基因启动子区甲基化后，其表达降低，对Wnt信号通路的抑制作用减弱，可诱发肿瘤。已有多项调查揭示了甲状腺恶性肿瘤与乳癌之间可能存在某种联系[3-5]。但到目前为止，两者间有无联系、通过何种途径发生联系尚无明确的结论。本研究以单纯甲状腺乳头状癌和甲状腺良性病变组织为对照，通过检测甲状腺、乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因mRNA表达及甲基化状态，旨在阐明其与多原发癌发生的可能关系。

1 材料和方法

1.1标本来源

收集青岛大学附属医院2007—2011年间33例甲状腺、乳房多原发癌病人的甲状腺癌组织(均为石蜡切块)，30例单纯甲状腺乳头状癌病人甲状腺癌组织(石蜡切块10例，新鲜组织20例)，20例甲状腺良性病变组织(均为新鲜组织)。新鲜组织切除后，液氮保存。

1.2方法

1.2.1DNA、RNA提取 应用氨-氯仿抽提方法从组织中提取DNA，按试剂盒(博日公司)的操作方法从组织中提取RNA。

1.2.2RT-PCR 按TaKaRa DRR037A试剂盒说明进行逆转录。引物由上海生工生物工程有限公司合成。WIF-1上游引物序列为5′-TCGTTAAAGCCT-GTCTGC-3′，下游引物序列为5′-CCTTTTATTGCAGTGTCTTCCA-3′，产物长度111 bp;β-actin上游引物序列为5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-CA-3′，下游引物序列为5′-CATCTCTTGCTCGAA-GTCCA-3′，产物长度318 bp。PCR扩增反应体系为25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。用20 g/L琼脂糖凝胶电泳并分析产物，凝胶成像自动分析系统观察结果。

1.2.3亚硫酸氨盐修饰DNA 将2 μg DNA和5.5 μL新鲜配制的 NaOH(3 mol/L)加入50 μL反应体系中，42 ℃水浴30 min，再加入10 mmol/L氢醌30 μL和3.6 mol/L亚硫酸氢钠520 μL，50 ℃避光水浴16 h。利用DNA纯化试剂盒(Promega公司)纯化修饰过的DNA，加入5.5 μL NaOH，37 ℃水浴15 min，加入10 mol/L乙酸铵33 μL和冰无水乙醇270 μL沉淀过夜(-20 ℃)，离心，沉淀经体积分数0.70乙醇洗涤后，重溶于去离子水中待用。

1.2.4甲基化特异性PCR(MSP) 以亚硫酸氢盐修饰的DNA为模板进行扩增。甲基化和未甲基化的WIF-1基因启动子引物由上海生工生物工程有限公司合成。MSP-M上游引物序列为5′-GGGCCTTT-TATTGGGCGTAT-3′，下游引物序列为5′-AAAC-CAACAATCAACGAAC-3′，产物长度198 bp；MSP-U上游引物序列为5′-GGGTGTTTTATTGGGT-GTAT-3′，下游引物序列为5′-TCCTAAATACAA-ACTCTCCTC-3′，产物长度为198 bp。反应条件：95 ℃预变性10 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像自动分析系统观察结果。结果判定：利用甲基化引物能扩增出产物、未甲基化引物不能扩增出产物为完全甲基化，相反情况为完全未甲基化，两者都能扩增出产物为部分甲基化。

1.2.5统计学方法 采用SPSS 18.0软件包进行数据分析，Bonferroni法比较3组基因表达缺失有无差异，若有差异，采用分割法进行两两比较。3组比较时α=0.05，两两比较时α′=0.0167。

2 结 果

2.1WIF-1基因mRNA表达

多原发癌病人甲状腺癌组织、单纯甲状腺乳头状癌组织和甲状腺良性病变组织WIF-1基因的表达缺失率分别为51.5%(17/33)、36.7%(11/30)和15.0%(3/20)，3组间比较差异有统计学意义(χ2=7.105，P<0.05)。多原发癌病人甲状腺癌组织中WIF-1基因mRNA的表达缺失率显著高于甲状腺良性病变组织(χ2=7.067，P<0.01)。见图1。

2.2WIF-1基因启动子甲基化状态

多原发癌病人甲状腺癌组织、单纯甲状腺乳头状癌组织和甲状腺良性病变组织WIF-1基因的甲基化率分别为45%(15/33)、43%(13/30)、10%(2/20)，3组比较差异有统计学意义(χ2=7.834，P<0.05)。组间两两比较，多原发癌病人甲状腺癌组织、单纯甲状腺乳头状癌组织WIF-1基因的甲基化率明显高于甲状腺良性病变组织，差异有显著性(χ2=6.349、7.185，P<0.01)；而多原发癌病人甲状腺癌组织与单纯甲状腺乳头状癌组织相比差异无显著性(P>0.05)。见图2。

M:DNA Marker；①、③、⑤、⑦为甲状腺、乳房多原发癌组织；②、④、⑥、⑧为单纯甲状腺乳头状癌组织；⑨为甲状腺良性病变组织；H2O：空白对照。

图1 WIF-1基因mRNA表达电泳结果

P：阳性对照；T：甲状腺、乳房多原发癌组织；N：单纯甲状腺乳头状癌组织；B：甲状腺良性病变组织；H2O：空白对照；U：未甲基化DNA；M：甲基化DNA。

图2 WIF-1基因mRNA甲基化检测结果

2.3WIF-1基因表达与其甲基化发生的关系

在WIF-1 mRNA表达缺失的17例甲状腺、乳房多原发癌病人甲状腺癌组织中，12例发生了甲基化，而在16例WIF-1 mRNA表达阳性的组织中，仅3例发生了甲基化；11例WIF-1 mRNA表达缺失的单纯甲状腺乳头状癌组织中，共有9例发生了甲基化，而表达阳性的19例中，仅3例发生了甲基化；在3例WIF-1 mRNA表达缺失的甲状腺良性病变组织中有2例检测出WIF-1基因启动子区甲基化，其余17例WIF-1 mRNA表达阳性的组织未检出甲基化。WIF-1 mRNA的表达与其甲基化的发生有密切联系(χ2=4.043，P<0.05)。

3 讨 论

Wnt信号通路参与调控细胞增殖与分化等活动，其基因表达异常可诱发肿瘤发生。WIF-1基因位于人染色体的12q14.3，其编码的蛋白为保守型分泌性WIF-1蛋白，该蛋白能抑制Wnt的活性。启动子区域CpG岛的甲基化可使WIF-1基因所编码的WIF-1蛋白下调或缺失，从而不能阻断Wnt信号通路，致核内靶基因活化，促进肿瘤的发生发展。在多种肿瘤细胞株和组织中均发现WIF-1基因下调并伴有启动子甲基化[6-8]。

本文的结果显示，多原发癌病人甲状腺癌组织、单纯甲状腺乳头状癌组织、甲状腺良性病变组织中WIF-1基因的表达缺失率差异有显著性。提示甲状腺、乳房多原发癌的发生可能与WIF-1 mRNA的表达缺失密切相关。MSP检测结果显示，甲状腺良性病变组织WIF-1基因的甲基化率明显低于多原发癌和单纯甲状腺癌组织，尽管甲状腺、乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因甲基化率较单纯甲状腺乳头状癌组织高，但差异无统计学意义。推测WIF-1基因启动子区异常甲基化可能是引起其mRNA低表达的机制之一。尽管甲状腺、乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因甲基化率较单纯甲状腺乳头状癌组织高，但差异无显著性，而两者mRNA表达差异有显著性。原因可能为：WIF-1基因mRNA表达受到多种因素的调控，高甲基化状态只是其低表达的机制之一；标本数量有限。

综上所述，甲状腺癌(包括甲状腺、乳房多原发癌和单纯甲状腺乳头状癌)的发生可能与WIF-1基因mRNA的低表达有密切联系，而WIF-1基因启动子区高甲基化可能是其低表达的机制之一。

[1] FUSCO A, CHIAPPETTA G, HUI P, et al. Assessment of RET/PTC oncogene activation and clonality in thyroid nodules with incomplete morphological evidence of papillary carcinoma: a search for the early precursors of papillary cancer[J]. Am J Pathol, 2002,160(6):2157-2167.

[2] HERMAN J G, BAYLIN S B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation[J]. N Engl J Med, 2003,349(21):2042-2054.

[3] SMYTH P P, SMITH D F, MCDERMOTT E W, et al. A direct relationship between thyroid enlargement and breast can-cer[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1996,81(3):937-941.

[4] MICHALAKI V, KONDI-PAFITI A, GENNATAS S, et al. Breast cancer in association with thyroid disorders[J]. J BUON, 2009,14(3):425-428.

[5] 钟源,江学庆,李海,等. 二例乳腺及甲状腺多原发癌[J]. 中华内分泌外科杂志, 2012,6(1):36-37.

[6] MAZIERES J, HE B, YOU L, et al. Wnt inhibitory factor-1 is silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer[J]. Cancer Res, 2004,64(14):4717-4720.

[7] BATRA S, SHI Y, KUCHENBECKER K M, et al. Wnt inhibitory factor-1, a Wnt antagonist, is silenced by promoter hypermethylation in malignant pleural mesothelioma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006,342(4):1228-1232.

[8] LIN Y C, YOU L, XU Z, et al. Wnt signaling activation and WIF-1 silencing in nasopharyngeal cancer cell lines[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006,341(2):635-640.

(本文编辑 马伟平)

mRNA EXPRESSION AND PROMOTER METHYLATION OF WIF-1 GENE IN THYROID CANCER TISSUES OF PATIENTS WITH MULTIPLE PRIMARY CARCINOMAS OF BREAST AND THYROID

YUJintang,DIAOLi,LIJunping,XUShichen

(Department of Endocrinology, Haiyang Hospital, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Haiyang 265100, China)

ObjectiveTo investigate mRNA expression and the promoter methylation of WIF-1 gene in thyroid cancer tissue of patients with multiple primary carcinoma of thyroid (MPCT) and breast.MethodsThe mRNA expression and the promoter methylation of WIF-1 gene in 33 cases of thyroid cancer tissues in patients with multiple primary breast cancer (MPBC) and MPCT were analyzed by reverse transcription PCR (RT-PCR) and methylation specific PCR, and 30 cases of simple papillary thyroid carcinoma (SPTC) tissues and 20 cases of benign thyroid (BT) tissues served as controls.ResultsThe gene deletion rates of WIF-1 expressions in MPCT, SPTC and BT were 51.5% (17/33), 36.7% (11/30) and 15.0% (3/20), respectively, the diffe-rence between the three groups being significant (χ2=7.105,P<0.05). Methylation of WIF-1 gene in MPCT and SPTC was 45% (15/33) and 43% (13/30), respectively, which were higher than 10% (2/20) of BT, the difference being significant (χ2=6.349,7.185;P<0.01), but there was no significant difference between MPCT and SPTC (P>0.05).ConclusionThe absence of WIF-1 gene mRNA expression plays a key role in the process of the occurrence of multiple primary carcinomas in breast and thyroid. The promoter hypermethylation of WIF-1 gene is likely to be one of the mechanisms of low expression of its mRNA.

neoplasms, multiple primary; thyroid neoplasms; breast neoplasms; WIF-1; DNA methylation

2014-06-23;

2014-10-21

于进堂(1965-)，男，副主任医师。

R736.1

A

1008-0341(2015)02-0144-03