江苏徐州地区慢性乙型肝炎病人HBV耐药突变分析

赵玉宝，丁芹，潘玉，王莉娜，张言超

(徐州医学院附属医院感染性疾病科，江苏 徐州 221002)



江苏徐州地区慢性乙型肝炎病人HBV耐药突变分析

赵玉宝，丁芹，潘玉，王莉娜，张言超

(徐州医学院附属医院感染性疾病科，江苏 徐州 221002)

目的 分析徐州地区慢性乙型肝炎(CHB)病人乙型肝炎病毒(HBV)基因型及耐药变异位点的分布特点。方法 收集2013年5月—2013年11月在我院就诊的门诊及住院CHB病人216例，采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法检测病人血清HBV DNA，通过测序分析检测病人血清中的HBV基因分型及耐药变异位点。结果 本组216例病人中，HBV基因C型207例(95.83%)，B型9例(4.17%)；病毒变异的85例，无变异的131例，变异率为39.35%；变异位点有rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtS202、rtM204、rtV207、rtS213、rtV214、rtQ215、rtN236、rtN238。各突变位点中，rtM204和rtL180位点的突变检出率较高，分别为21.30%和13.89%。与拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定耐药相关的病毒基因位点的突变检出率分别为29.63%、20.37%、12.96%。结论徐州地区HBV基因型分布以C型多见，突变株占检测病毒株的39.35%；与拉米夫定和阿德福韦酯耐药相关的基因位点突变检出率相对较高，与恩替卡韦耐药相关的基因位点突变检出率相对较低。

肝炎病毒，乙型；基因型；突变

口服核苷(酸)类似物方法是目前抗乙型肝炎病毒(HBV)治疗的重要手段之一。为了解江苏徐州地区HBV耐药位点分布特点，本文分析了我院216例慢性乙型肝炎(CHB)病人血清HBV基因分型及耐药位点，旨在为临床提供更好的抗病毒用药依据。

1 资料与方法

1.1一般资料

2013年5月—2013年11月，我院住院及门诊就诊的CHB病人216例，其中男158例，女58例；平均年龄(40.78±12.75)岁。

1.2试剂与仪器

ABI 7500实时荧光定量PCR系统由美国ABI公司提供，HBV及耐药突变检测试剂盒由上海申友生物技术有限责任公司提供。

1.3方法

1.3.1标本采集 空腹采集病人不抗凝血3 mL，以2 000 r/min离心5 min分离血清，置1.5 mL离心管中-20 ℃储存备用。

1.3.2血清HBV DNA检测 采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法。PCR扩增步骤如下。①HBV DNA模板提取：按照上海申友生物技术有限公司试剂盒说明书进行。②PCR反应：每个反应加入HBV PCR反应液20 μL，Taq酶及UNG酶1 μL，标本、临界对照、阳性对照、阴性对照或者定量参比品各4 μL。反应条件：42 ℃保温5 min，94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性7 s，60 ℃退火30 s，45个循环；37 ℃恒温保温。③PCR产物酶解：自HBV DNA≥5×106U/L的样本中取PCR产物3 μL，加入2 μL SAP的混合物，混匀，37 ℃下作用60 min，80 ℃下作用15 min，然后4 ℃下保存。④PCR酶解产物的测序：取PCR酶解产物3 μL，加测序试剂(bigdye)1 μL和测序引物2 μL进行扩增，反应条件为96 ℃变性1 min，96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，25个循环，最后4 ℃恒温保存。

1.3.3测序产物纯化及耐药突变位点检测 按照上海申友生物技术有限责任公司说明书步骤进行，在ABI公司3130型基因测序仪上进行检测。

1.4统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行分析，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本文216例受检样本中检测到病毒变异85例，变异率为39.35%。各位点变异例次及相关耐药情况见表1。在所检测到的HBV耐药变异中，拉米夫定相关变异(173、180、204、207、213位点)共检测到99例次，存在于64例样本中(变异率29.63%)；阿德福韦酯相关变异(181、207、214、215、236、238位点)共检测到57例次，存在于44例样本中(变异率20.37%)；替比夫定相关变异204位点I变异28例次(变异率12.96%)；180+204位点联合变异27例次(变异率12.50%)等，变异率比较差异有显著意义(χ2=2 292.0，P<0.05)。

表1 HBV各位点变异及相关耐药情况

3 讨 论

核苷(酸)类似物是治疗CHB的重要药物之一，但近年来随着核苷(酸)类似物的广泛应用，其耐药变异问题已引起大家的广泛关注。所有核苷(酸)类似物耐药基因突变位点都位于HBV DNA聚合酶基因区(逆转录酶区)，目前已知常见的耐药突变位点主要见于逆转录酶区的A、B、C、D区[1]。

研究显示，与拉米夫定相关主要耐药突变位点有rtL180M、rtM204V和rtM204I[2]。本研究中检测到rtL180M变异30例次，rtM204V变异19例次，rtM204I变异28例次，此外尚有报道称173L、207I/L/M、213T位点亦与拉米夫定耐药相关。本实验检测结果显示，173L变异2例次，207I、L、M变异9例次，213T变异11例次。以上所有与拉米夫定耐药相关的位点的变异率为29.63%，提示拉米夫定的变异率较高。郭香娟等[3]研究结果表明，拉米夫定诱导的YMDD变异组的HBV DNA转阴率明显低于YMDD未变异组，以上研究都提示拉米夫定不宜作为临床抗病毒治疗的首选药物。

阿德福韦酯的主要相关变异位点有rtA181V和rtN236T[4]。本研究检测到181位点变异例次为22例次(变异率10.19%)，236位点变异7例次(变异率3.24%)，尚有报道称rtQ215S/P/H、rtV181A、rtN238H、rtM207V、rtL180M等位点亦与阿德福韦酯耐药发生有关。本研究结果显示，207位点变异9例次，214位点变异6例次，215位点变异3例次，238位点变异6例次，综合以上所有与阿德福韦酯耐药相关的基因位点的变异率为20.37%。提示单独应用阿德福韦酯产生耐药的可能性较大。

替比夫定和拉米夫定耐药基因序列相似。临床观察显示，替比夫定的耐药位点只存在于rtM204I。本研究检测到此位点变异28例次，说明替比夫定经典耐药发生率也较高。还有文献报道80、180、181、229位点变异也与替比夫定变异有关[5]，本研究检测到上述基因位点的变异率为24.07%。虽然目前替比夫定的耐药率比拉米夫定低，但其耐药率仍有进一步升高的风险。

恩替卡韦作为目前抗HBV病毒的一线药物，很少发生耐药，其5年病毒耐药率<1.2%[6]，这主要是因为恩替卡韦是在204+180位点突变的基础上发生耐药的。此外有报道rtT184、rtS202位点也参与恩替卡韦耐药的发生[7]。本研究检测到180+204位点变异共27例次，其中恩替卡韦耐药必需的180M+204V 位点变异14例次，180M+204V及I位点变异2例次，总共16例次，变异率仅为7.41%。另外有184位点变异3例次(2.00%)，202位点变异4例次(2.67%)，但它们不能单独诱发恩替卡韦耐药，故恩替卡韦的耐药率很低，可作为临床核苷(酸)类似物中抗病毒治疗的首选药物。

替诺福韦酯的主要耐药位点是rtA194T[8]，由于该药尚未在国内上市，本地区尚未发现该药的天然耐药病例。

总之，通过对本地区CHB病人核苷(酸)类似物耐药位点的分析，初步了解了本地区CHB病人HBV耐药突变情况，可更好地指导临床用药。

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[4] BORROTO-ESODA K, MILLER M D, ARTERBURN S. Pooled analysis of amino acid changes in the HBV polymerase in patients from four major adefovir dipivoxil clinical trials[J]. J Hepatol, 2007,47(4):492-498.

[5] LOCARNINI S. Primary resistance, multidrug resistance, and cross-resistance pathways in HBV as a consequence of treatment failure[J]. Hepatol Int, 2008,2(2):147-151.

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(本文编辑 厉建强)

A RESISTANCE MUTATION ANALYSIS OF HBV IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS B IN XUZHOU AREA OF JIANGSU PROVINCE

ZHAOYubao,DINGQin,PANYu,WANGLi′na,ZHANGYanchao

(Department of Infectious Disease, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)

ObjectiveTo analyze the gene mutation site and genotyping distribution of hepatitis B virus (HBV) in patients with chronic hepatitis B (CHB) in Xuzhou area.MethodsThis study consisted of 216 patients with CHB treated in our hospital from May 2013 to November 2013. Employing combined Nucleic Acid Amplification Techniques with fluorescent labeling hybridization method, their serum HBV DNA was detected and HBV genotyping and resistance variation site were analyzed.ResultsAmong 216 patients, 207 cases (95.83%) were genotype C, nine (4.17%) were genotype B; virus variant was noted in 85 cases, and 131 cases with no variant, aberration rate being 39.35%; variation sites were rtV173, rtL180, rtA181, rtT184, rtS202, rtM204, rtV207, rtS213, rtV214, rtN236 and rtN238. In the mutable points, the detection rates in rtM204 and rtL180 were 21.30% and 13.89%, respectively. The mutation rates of lamivudin-, adefovir-, telbivudin-related virogene locus were 29.63%, 20.37%, 12.96%, respectively.ConclusionIn Xuzhou area, genotype C is more commonly seen in HBV genotype distribution, the mutation strains accounts for 39.35% in the strains detected. The detection rates are relatively higher in lamivudine-and adefovir-resistance points, but lower in entecavir-related point.

hepatitis B virus; genotype; mutation

2013-03-11;

2014-05-28

江苏省高校自然科学基础研究面上项目(08KJD-320012)，徐州医学院研究生科技创新计划项目(XYLC-1208)

赵玉宝(1988-)，男，硕士研究生。

丁芹(1970-)，女，博士，副主任医师，副教授。Email：kgylan163@163.com。

R512.6

A

1008-0341(2015)02-0170-03