乳腺癌T7噬菌体展示cDNA文库的构建

张 涛，施宝民，王 洪，陈鹊汀，季 堃，余松林.同济大学附属同济医院普外科，上海 00065；.河北大学附属医院肿瘤外科，保定 03000

乳腺癌T7噬菌体展示cDNA文库的构建

张 涛1，施宝民1，王 洪2，陈鹊汀2，季 堃1，余松林1
1.同济大学附属同济医院普外科，上海 200065；
2.河北大学附属医院肿瘤外科，保定 031000

目的 构建乳腺癌组织T7噬菌体展示cDNA文库，为下一步筛选差异蛋白打下基础。方法 利用乳腺癌新鲜标本，提取总RNA，分离mRNA并进行纯化，然后合成cDNA，连接体外包装获得T7噬菌体展示cDNA文库。结果 总RNA经检测，A 260／A 280＝1.87，纯化的mRNA产量为4.0μg，A 260/A 280=1.91，合成的cDNA大小在200～6000bp之间，原始文库的容量为2×107pfu，文库重组率为90％，插入片段长度在300～2000bp之间。结论 噬菌体展示技术是进行蛋白质功能研究的高效方法，构建高质量的乳腺癌噬菌体展示cDNA文库，可用于肿瘤标志物的筛选、肿瘤疫苗的研制、多肽药物的开发、靶向治疗的研究等众多领域。

乳腺癌；噬菌体展示；cDNA文库

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，早期发现、早期诊断、早期治疗是提高疗效的关键，在乳腺癌发生、发展的早期阶段，血液中的一些蛋白质即有微量变化，这些蛋白质为实现早期诊断和监测复发转移提供了线索。噬菌体展示技术是研究蛋白质间相互作用的一种有效手段，利用该技术可以发现这些微量蛋白并进一步研究其功能[1]。因此，构建噬菌体展示cDNA文库是所有研究工作的基石，本研究即首先构建了乳腺癌组织T7噬菌体展示cDNA文库，为下一步筛选差异蛋白打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

5例乳腺癌组织取自经病理证实的乳腺癌患者，5例癌组织剪碎后混合，最后取10 g混合组织备用。

·论 著·

TRIzol试剂，RNA分子量标准购自Invitrogen公司，Oligotex mRNA kit购自Giagen公司，T7 Select 10-3 Orient Express Random Primer cDNA cloning System试剂购自Novagen公司，PCR引物由上海博亚公司合成，Taq RNA聚合酶购自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取和mRNA分离

将液氮冻存的新鲜乳腺癌组织称重后加液氮快速研磨成粉末状，按1m l/50mg组织加入TRIzol混匀，4℃12000 g离心10m in，取上清，室温孵育5分钟后，按0.2m l/m l TRIzol加入氯仿，剧烈振荡至完全乳化，4℃12000 g离心15m in，将上层水相转移到一个新管中，加入等体积异丙醇，4℃12000 g离心10m in，弃上清，加入1m l 75％乙醇混匀，4℃12000 g离心10 m in，弃上清，沉淀于空气中干燥后，溶于DEPC处理的水中，用紫外分光光度法测定总RNA浓度及纯度，用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。

1.2.2 mRNA的分离纯化

按照试剂盒操作说明，用OligotexmRNA kit进行mRNA的分离纯化，用紫外分光光度法测定mRNA浓度及纯度，用1％琼脂糖凝胶电泳检测mRNA质量。

1.2.3 cDNA的合成

以4μg mRNA为模板，应用随机引物，在MMLV逆转录酶作用下合成第1链cDNA，而后在Rnaseh，DNA聚合酶I和DNA连接酶作用下合成第2链cDNA，由此得到dscDNA，然后在T4 DNA聚合酶作用下末端补平，与EcoR I和Hind IV接头连接，经EcoR I和Hind III酶切后得到末端为黏性的cDNA分子，通过Orient Express Random Primer cDNA cloing System提供的size fractionation试剂盒去处多余的接头及长度在300bp以下的小片段cDNA，1％TAE琼脂糖凝胶电泳检测cDNA质量。

1.2.4 cDNA与T7 Select 10-3载体的连接与体外包装

按插入片段：载体摩尔比2∶1，将0.02 pmol得到的cDNA与0.01 pmol T7 Select10-3载体在16℃连接反应产物，在25μl T7噬菌体包装物中加入5μl上述连接反应产物，22℃2h，得到具有感染性的T7噬菌体颗粒。

1.2.5 噬菌体文库的扩增

将全部包装产物与BLT 5430菌液混合，按5× 104个噬菌体斑/板，铺150mm LB平板，37℃倒置培养3～4h，平板上噬菌体斑长到1～2mm时，每块板加10m l噬菌体提取缓冲液覆盖平板，4℃存贮过夜，次日收集噬菌体提取缓冲液，加0.5m l氯仿，3000 g离心5m in，收集上清，取10μl上清进行梯度稀释，铺板，测定扩增后噬菌体展示文库的滴度，在扩增产物中加入1/10体积80％的灭菌甘油，分装后－70℃保存。

1.2.6 原始及扩增文库质量检测

原始文库噬菌体按104，105，106，扩增文库按108，109，1010稀释后铺板测定文库容量，从铺板所得的噬菌体班中随机挑选分离良好的单个噬菌体斑，用灭菌拾头沾取少量噬菌体加入100μl10mmol/EDTA中，混匀，65℃，14000 r/m in离心10m in去除不溶物，取1.5μl上清加入50μl PCR体系中（加5μl 10× PCR反应缓冲液，3μl 25mmol/LMgCl2，0.2mmol/L dNTP，0.1mmol/L正向及反向引物），80℃热启动2m in，然后加入2 u Taq DNA聚合酶，PCR循环参数：94℃50 s，50℃1m in，72℃1m in，35个循环后72℃延伸6m in，1％琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小，并计算文库重组率。

2 结果

2.1 总RNA的提取

从乳腺癌组织中提取的RNA，经紫外分光光度计检测，A260／A280＝1.87，表明提取的总RNA纯度较高。琼脂糖凝胶电泳结果显示28S和18SRNA条带均清晰，说明提取的总RNA未发生明显降解，完整性好。

2.2 mRNA的分离纯化

纯化的mRNA产量为4.0μg，A 260/A280=1.91，表明分离纯化的mRNA纯度高，可以用于cDNA的合成。

2.3 cDNA的合成

将4μgmRNA用于合成双链cDNA，琼脂糖凝胶电泳可见合成的cDNA大小在200～6000bp之间，平均长度1～2 kb，说明cDNA质量完全符合文库构建的要求。

2.4 T7噬菌体展示文库的质量鉴定

通过连接体外包装后获得T7噬菌体展示cDNA文库，经稀释后铺平板测定，原始文库的容量为2×107pfu，对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定，文库重组率为90％，插入片段长度在300～2000bp之间，我们已构建了较好质量的噬菌体展示文库。

3 讨论

人类基因组计划完成后就进入了功能基因组时代，研究基因编码的各种蛋白质功能。噬菌体展示技术是近年来建立和发展起来的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术[2]，实现了基因型和表型的结合。该技术将编码蛋白质的cDNA序列克隆入噬菌体的基因序列上，这样cDNA编码的蛋白或多肽就与噬菌体外壳蛋白融合表达，从而构建出蛋白质的表面展示文库，应用T7噬菌体展示系统所构建的cDNA文库与其他传统的cDNA文库相比，有以下3个特点：1）文库容量更为丰富，T7是裂解性噬菌体，其展示的蛋白无需分泌，这就使得更多的序列可能被展示[3]。2）文库范围更广，可以通过受体与配体结合的方式，从文库中筛选到与任何靶标相结合的分子[4]，而且筛选出的噬菌体还可以在大肠埃希菌中进行再扩增，从而可以进行连续多轮的筛选，得到高亲和力的噬菌体，进而获得其编码cDNA[5]。3）操作简便，效率高，噬菌体展示的表达产物与其编码基因在同一噬菌体颗粒上建立起一一对应的关系，使人们可以容易地对其进行一系列的生化和遗传操作[6-7]。因次噬菌体展示技术为蛋白质研究提供了良好的技术平台。本研究中我们构建了高质量的乳腺癌噬菌体展示cDNA文库，为下一步筛选肿瘤标志物奠定了基础。

为了构建高质量的噬菌体展示cDNA文库，首先要保障RNA的质量，在操作过程中防止RNA降解，经分离纯化后，最终要获得纯度较高的mRNA，经紫外分光光度法测定，其A 260/A280在1.8～2.0才符合进一步建库的要求。

构建cDNA文库时，可以用2种方法来合成单链cDNA，一种是用Oligo（dT）引导cDNA合成，另一种是用随机引物引导cDNA合成，由于Oligo（dT）只能从模板mRNA的3’末端起始引发cDNA的合成，而现有的反转录酶在cDNA反转录合成中的行进能力有限（平均1 kb以下），这使得Oligo（dT）引物反转录合成的cDNA通常都缺少模板mRNA 5’端的重要信息，而随机引物引导cDNA合成时，在一条模板mRNA上同时杂交多个引物序列，从而在多个位点上同时引发cDNA反转录合成，可以在同一模板上合成多条相互重叠的cDNA片段，克服了Oligo（dT）引导合成法的缺点，更有效地反映表达mRNA全长序列信息[8，9]，因此，本研究采用随机引物策略合成cDNA，更有可能获得含有完整开放阅读框的cDNA片段，该法可以合成出大小长度不等的cDNA片段，它们分别代表了mRNA各部分区域序列，反映出mRNA所携带的信息。另外，据SCOP数据库推算，如果文库中cDNA插入片段达到300bp以上，就可以代表蛋白质的各个功能域[10]。本研究所建文库的cDNA插入片段长度在300～2000bp，表明文库中重组cDNA片段能代表蛋白质的各功能域的序列信息。当文库建成后，为了保证后续研究的有效性，首先要对文库质量进行评估，从理论上讲，当一个cDNA文库具有106以上的库容量时，就能以99％的概率保证文库中包含有细胞表达出的任何一种mRNA序列信息[11]。本研究所构建的文库中包含2×107克隆子，具有较高的库容量，完全可以满足进一步研究的需要。

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Constructbreast carcinoma T7 phage disp lay cDNA library

ZHANG Tao1，SHIBaomin1，WANGhong2，CHENQueting2，JIKun1，YU Songlin1
1.DepartmentofSurgery，TongjiHospital，TongjiUniversity SchoolofMedicine，Shanghai 200065，China；
2.DepartmentofOncology Surgery，AffiliatedhospitalofHebeiUniversity，Baoding 031000，China

Ob jective To construct the breast carcinoma T7 phage display cDNA library，so the foundation for the screening of differentially expressed proteinswas laid.M ethods Firstly，fresh specimens of breast carcinomawas used to extract total RNA，separating and purifying ofmRNA.Then synthesis cDNA w as done.A t last，the packaging was connected in vitro and T7 phage display cDNA library was obtained.Resu lts The total RNA was tested，the result is A260/A280＝1.87.The purified mRNA is 4.0μg，A260/A280=1.91.The size of cDNA is 200－6000bp.The primary library capacity is 2×107pfu.Recombination rate of the library is 90％.The length of inserted fragments is 300－2000bp.Conclusions Phage display is an efficientmethod of protein function research.We constructed ahigh quality breast cancer phage display cDNA Library.The library can be used for screening tumormarkers，tumor vaccine，polypeptide drug development，targeted research，and so on.

Breastcancer；Phage display；cDNA library

R737.9

A

2095-378X（2015）01-0009-03

10.3969/j.issn.2095-378X.2015.01.003

张 涛（1972—），男，主任医师，医学博士，研究乳腺癌的临床和基础研究；电子信箱：Doctor.zt@163.com