禽呼肠孤病毒σ B蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

陈 祥，吴海洋，王永强，李晓齐，曹 红，郑世军

（中国农业大学动物医学院 农业生物技术国家重点实验室，北京 海淀 100193）

禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）属于呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属[1]，于1954 年最早从鸡体内分离得到[2]，20 世纪80 年代中期我国也出现了此病的报道[3]。ARV可以引起关节炎、腱鞘炎、肉鸡发育迟缓综合征（RSS）、呼吸障碍综合征（MAS），以及呼吸系统疾病等[4-5]，给养禽业造成巨大经济损失。

ARV无囊膜，有双层衣壳，属于双股RNA（dsRNA）病毒[6]。病毒含有10 个双股RNA片段，这些片段至少编码10 个结构蛋白和4 个非结构蛋白[7]。

σB蛋白是由S3 片段编码，包含367 个氨基酸，是病毒粒子外衣壳的重要组成部分[8]，该蛋白分别在N末端和C末端存在一个功能上相互独立的基序，即N末端的锌指基序，C末端的核苷酸结合基序[9]。σB蛋白携带有病毒型特异性中和反应的表面抗原，能诱导宿主产生群特异性中和抗体[10]。本研究成功表达了σB重组蛋白并制备出针对它的单克隆抗体，为进一步研究ARV的致病机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒、病毒、细胞与实验动物 sp2/0 细胞、DF-1 细胞、DH5α、BL21、质粒pGEX-6P-1、pET-28a、已纯化的His-VP2 和GST-VP2 蛋白由本实验室保存等均由本实验室（中国农业大学动物医学院免疫生物学实验室）保存；ARVS1133 毒株由中国农业大学人畜共患病研究室苏敬良老师惠赠；6～8 周龄雌性BALB/c 小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所。

1.2 仪器及主要试剂 HAT、HT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，均购自Sigma公司；胎牛血清，购自HyClone公司；DMEM高糖培养基，购自Gibco 公司；PEG4000，购自Merck 公司；HRP 标记山羊抗小鼠IgG，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；限制性内切酶，购自NEB公司；LATaq酶和DNA快速链接试剂盒，购自TaKaRa 公司；dNTPs，购自CNS公司；96 孔酶标仪，购自Tecan 公司；压力搅拌式浓缩杯，购自默克化工技术（上海）有限公司。

1.3 抗σB蛋白单克隆抗体的制备 小鼠免疫程序按文献[11]所述方法进行。细胞融合，阳性杂交瘤的筛选参照Current Protocol in Immunology 的方法[12]。腹水纯化按照正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法[13]进行。

1.4 抗σB蛋白单克隆抗体的鉴定

1.4.1 单克隆抗体的Western Blot 检测 将DF-1细胞接种于24 孔板，4×105细胞/孔，待细胞密度达到70%时，将ARV接种细胞，培养24 h 后，收取相应细胞裂解物进行Western blot 鉴定，一抗为含有单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清液。

1.4.2 单克隆抗体亲和力的测定及亚类鉴定 按照间接ELISA方法测定单克隆抗体的亲和力，数据的处理分析按照文献[14]所述方法。用抗体亚类检测试剂盒，按照试剂盒说明书进行单克隆抗体亚类的鉴定。

1.4.3 单克隆抗体的特异性鉴定 将实验室保存的禽呼肠孤病毒（ARV），传染性腔上囊病病毒（IBDV），禽白血病病毒（ALV），鸡传染性贫血症病毒（CAV），禽网状内皮组织增殖病病毒（REV）感染细胞后收取的细胞裂解物进行电泳，用制备的σB单抗为一抗进行Western Blot 检测。

1.4.4 间接免疫荧光试验（IFA）鉴定单抗 按照1.4.1 所述方法进行病毒感染，并设置相应的阴性对照。培养24 h 后，用4%多聚甲醛固定和0.2%Triton X-100 透化处理，用10%山羊血清封闭后加入制备的单抗作为一抗，以TRITC标记的抗鼠IgG抗体为二抗，经反应、洗涤后，置于荧光显微镜下进行检测。

1.4.5 单克隆抗体抗原识别区的确定 以σB不同截短的重组蛋白为抗原，以制备的单抗为一抗，通过Western blot 分析两株单抗可能识别的抗原表位所在区域。

2 结果

2.1 抗σB蛋白单克隆抗体的制备及特异性鉴定如图1 所示，2 株单抗较纯且均能特异识别ARV感染细胞后产生的σB蛋白。

图1 单抗的纯化和特异性鉴定

2.2 单克隆抗体亚类鉴定及亲和力测定 3C3 与4H11 杂交瘤细胞株分泌的单抗亚类分别为IgG2a 和IgG2b。2 株单抗亲和力解离常数（Kd）分别为5.17×10-10、5.04×10-10（图2），均属于高亲和力抗体（图2）。

如中插彩版图3 所示，获得的单抗能识别ARV天然病毒蛋白σB抗原。

图2 σB单克隆抗体亲和力测定

图4 单抗抗原表位识别区分析（一）

2.3 单克隆抗体抗原识别区的确定 用分子生物学技术将σB蛋白截短并在原核细胞中表达，用Western Blot 方法检测2 株单抗对于截短蛋白的识别情况，2 株单抗的抗原识别位点位于101 aa～167 aa之间（图4）。

根据上述方法进一步表达σB不同截短蛋白，结果表明，3C3 株单抗的抗原识别位点能初步预测在101 aa～120 aa 之间，4H11 株单抗识别位点初步预测在121 aa～140 aa 之间（图5）。

3 讨论

ARV广泛存在于自然界，现已从许多鸟类中发现。包括巨噬细胞在内的多种组织细胞可受到ARV感染，引起宿主免疫功能下降，加剧其他病原的致病性。σB蛋白携带有群特异性中和抗原决定簇，在ARV的感染和致病机理上有重要作用。

ARVσB蛋白与番鸭呼肠孤病毒（MDRV）σB蛋白氨基酸序列有62%的相似性[15]，本试验筛选出的2 株单抗均能与天然病毒蛋白σB发生反应，说明获得的单抗具有良好的生物学活性。本研究期望在2 株单抗中鉴定出可以同时与禽和番鸭呼肠孤病毒发生发应，或能够区分ARV和MDRV的单抗，为ARV和MDRV的鉴别诊断奠定了基础。在2007 年国内学者制备出了针对ARVσC蛋白[16]的单克隆抗体。在ARV单克隆抗体抗原识别区的确定方面，Chunhong Yin 等[17]将ARVS1133 株σB单抗识别表位确定在21KTPACW26 之间和32WDTVTFH38 之间。虽然国内外已经制备出了多株针对ARV的单抗，但这些抗体的抗原识别区还不十分明确。详细的抗原表位分析对研制疫苗和诊断工具都很重要。本研究初步确定了3C3 和4H11 株单抗的抗原识别区，为研究表位疫苗奠定了基础。本研究中所获得的单抗具有高亲和力的特点，为深入研究ARV的致病机理提供了重要生物学材料。

图5 单抗抗原表位识别区分析（二）

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