牛源麦氏弧菌的分离鉴定及进化分析

方志超 ，罗梓桐，黄 攀，刀丽梅，单文杰，林 雅，范财良，程方俊

（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌402460 ；2.重庆市荣昌县畜牧局，重庆荣昌 402460）

麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）又称梅氏弧菌，是广泛存在自然界的致病性弧菌，也是国内外公认的致病性弧菌。主要存在于海水，河水，水产品和食品中。近年来，已从水源，牛粪便、鸡肝、苍蝇中分离出该菌[1-2]。V.metschnikovii可引起人类伤口感染、食物中毒、腹泻和败血症，是公共卫生学上重要的病原微生物。姜淑红等[3-5]人都曾报道过麦氏弧菌引起人腹泻，沈强[6]报道，从食物中检测出麦氏弧菌，并引起人的食物中毒。Hansen[7]等人报道麦氏弧菌导致败血症，呼吸道感染，伤口感染。在动物方面，朴范泽[8]报道雏鸡感染V.metschnikovii后出现突然发病、腹泻以及严重肠炎，死亡率高。杨瑛等[9]发现，V.metschnikovii与猪链球菌2 型具有较强的协同致病作用，可引起猪的死亡。

16SrRNA基因普遍存在于原核生物中，不同细菌具有非常相似的保守区又具有其特异性可变区。16SrRNA长约1 500 bp，便于测序和序列分析，因而它非常适合对细菌进行鉴定和系统进化关系研究，已经被越来越多的学者接受[10]。本试验通过传统细菌学鉴定和16SrRNA序列分析方法鉴定从牛上呼吸道分离出的3 株细菌，同时进行系统进化分析，了解其进化关系。动物致病性试验、药物敏感性筛选为今后进一步研究该菌致病情况、耐药性以及指导临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 用无菌棉签采集重庆、四川某牛场肉牛的鼻腔黏液，放入已灭菌的LB营养肉汤中，4 ℃保存，备用。

1.2 试验动物 健康家兔，20 日龄健康小鼠。

1.3 主要试剂和材料 实验室常规用品由西南大学荣昌校区预防兽医教研室提供；微量生化管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组提取试剂盒、PCR 产物凝胶回收试剂盒，均购自广州飞扬生物技术公司；Mix DL-2 000 Marker、6×Loading Buffer、PCR 试剂盒Premix ExTaq、无菌双蒸水，均购自宝生物工程（大连）有限公司；药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.4 引物 参考细菌16SrRNA通用引物（正向：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向：5′-GGT TACCTTGTTACGACTT-3′），由上海百力格有限公司合成。

1.5 病原分离 将样品接种到鲜血琼脂培养基，置于37 ℃恒温箱培养24 h，取单个菌落进一步纯化，经纯化的单个菌落保存于鲜血琼脂斜面，4 ℃保存备用。

1.6 培养特性及形态学观察 将分离菌株接种于TCBS培养基，置于37 ℃恒温箱培养24 h，观察细菌的生长情况及菌落特征。挑取培养基上单个菌落涂片，进行革兰染色，然后镜检。

1.7 生化试验 将分离菌株分别进行糖发酵试验（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）、吲哚试验、V-P 试验、M.R.试验、硫化氢试验、枸橼酸盐利用试验、氧化酶试验、硝酸盐试验，置于37 ℃恒温箱培养24 h～48 h，观察并记录结果。

1.8 16SrRNA基因的扩增及测序 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 经30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。

PCR 产物在1%琼脂糖凝胶电泳，结果照相保存。PCR 产物按照PCR 产物凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收，回收产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.9 同源性分析和系统进化分析 将分离菌株的16SrRNA基因序列通过NCBI 的Blast 检索系统进行同源性分析，并使用DNAStar 软件与从Gen-Bank 数据库中获得的16SrRNA基因序列构建系统进化树。

1.10 药敏试验 药敏试验按照CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）推荐的K-B法进行，判定标准参照美国实验标准委员会（NCCLS）药敏纸片扩散法规标准。

1.11 致病性试验 将该分离菌株DF309-1 于马丁肉汤中静置培养18 h，0.2 mL（8.7×108CFU/mL）剂量小鼠腹腔注射。并设立对照组，观察并记录小鼠的生理状况。

2 结果

2.1 培养特性及形态学观察 分离出3 株细菌分别命名为FD39-1、ZC3、ZC4。分离菌株在鲜血培养基中呈圆形、光滑、凸起的中等菌落，具有β-溶血现象。在TCBS培养基中呈黄色菌落，经革兰染色为革兰阴性弯曲杆菌。3 株分离菌株的生化特征见表1。

表1 分离菌株生化特征

2.2 16SrRNA基因的扩增 经16SrRNA基因扩增，扩得的凝胶电泳片段与目的片段大小一致（如图1）。

图1 分离菌株的扩增结果

2.3 同源性分析与进化树构建 将3 株分离菌的16SrRNA序列分别通过Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线比较，菌株FD39-1 与9株V.metschnikovii的相似性最高，为99%；菌株ZC3、ZC4 与18 株V.metschnikovii的相似性最高，为95%～96%。

选取GenBank 上登录的V.metschnikovii 的16SrRNA序列，利用DNAStar 软件分析，与3 株分离菌株进行系统进化树构建（如图2）；ZC3 与ZC4 位于同一分支，与印度分离株HQ658055.1、山东青岛分离株JX409930.1 进化关系较近，但与FD39-1 进化关系较远，虽然都属于V.metschnikovii，但不是同一个进化分支。菌株FD39-1 与韩国分离株KC634073.1（Vibrio sp.M12-1144）进化关系较近。

2.4 药敏试验结果 见表2。

2.5 致病性试验结果 接种FD39-1 菌株的小鼠主要表现为精神委顿，竖毛，活动减少，食欲下降，腹泻，24 h 全部死亡，剖检小鼠可见肠绒毛脱落，肠壁化脓性炎症。取肠内容物均分离出该菌。对照组精神状况良好，饲养1 周无死亡。

表2 药敏试验结果

3 讨论

本试验从肉牛上呼吸道分离到的3 株细菌在鲜血平板具有β-溶血现象，在TCBS培养基长出黄色菌落，各项生化结果均与已报道的V.metschnikovii生化特性一致[1，11]；分子鉴定采用16SrRNA基因鉴定方法，结果显示，3 株分离菌株FD39-1、ZC3、ZC4 的16SrRNA序列与V.metschnikovii的16SrRNA序列同源性分别为99.6%、95.9%、96.4%。结合培养形态特征和生化特征，可鉴定3株分离菌株为V.metschnikovii。利用DANStar 构建进化树，显示ZC3与ZC4进化关系很近，与FD39-1 的进化关系较远，不在同一个进化分支，这是由于ZC3、ZC4 菌株来源于四川某牛场，而FD39-1 菌株来源于重庆某肉牛场，不同地区V.metschnikovii的进化有所差异。ZC3 与ZC4 同印度分离株HQ658055.1、山东青岛分离株JX409930.1 进化关系较近，属于同一族。菌株FD39-1与韩国分离株KC634073.1 进化关系较近，位于第二族。

刘利芝[11]等人对V.metschnikovii耐药状况研究发现，对丁胺卡那霉素、羟氨苄青霉素和克拉维酸、氨苄西林和舒巴坦、先锋V、头孢替坦、庆大霉素、四环素敏感；对氨苄青霉素、先锋必、头孢噻肟、复达欣、环丙沙星、妥布霉素耐药；对哌拉西林中度敏感。李正义等[12]研究发现，V.metschnikovii对青霉素有耐药性，对氨舒钠和头孢唑啉中度敏感，对头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和磺胺甲恶唑/甲氧苄啶敏感。本试验药敏试验结果显示，菌株ZC3、ZC4 仅对头孢曲松、洛美沙星、头孢拉定敏感，环丙氟哌酸、青霉素等大多数药物耐药，耐药性较为严重；菌株FD39-1 对先锋霉素V、头孢曲松、洛美沙星、红霉素敏感，对青霉素、林克霉素耐药，这与李正义、王钦升报道一致。分析认为菌株ZC3、ZC4 来源于四川散养户，可能由于抗生素滥用导致细菌耐药性较为严重，FD39-1 来源于重庆某集约化牛场，管理规范，用药合理，因此没有严重的耐药性。

本试验中，采用小鼠进行致病性试验，孙延釜[2]、张晓玫[4]、刘利芝[11]等人在研究V.metschnikovii毒力试验中均采用小鼠作为试验动物，致病性试验中，接种FD39-1 菌株的小鼠先后发病，主要表现为精神委顿，竖毛，活动减少，饮食下降，腹泻，24 h 全部死亡，这与孙延釜[3]、刘利芝[11]等人的致病性试验结果一致，说明菌株FD39-1 有很强的致病力。

麦氏弧菌（V.metschnikovii）主要存在于水产品以及食物中，是一种致病性弧菌，易引起食物中毒。本试验采用传统细菌学鉴定方法和16SrRNA序列分析方法首次从肉牛上呼吸道分离并鉴定出3 株V.metschnikovii，证实V.metschnikovii存在于肉牛上呼吸道，可能肉牛上呼吸道潜在性病原，并可能成为食源性病原菌来源之一。因此对于V.metschnikovii的研究，不仅进一步研究V.metschnikovii成为肉牛上呼吸道感染潜在性病原奠定基础，在食品安全，公共卫生方面也有重要意义。

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