新型鸭呼肠孤病毒S组基因克隆及序列分析

卿柯香，袁远华，郭霄峰，黄淑坚

根据国际病毒分类委员会第九次报告，正呼肠孤病毒属依然分3 个亚群：第Ⅰ亚群包括不含融合基因的哺乳动物呼肠孤病毒（Mammalian reoviruses，MRV）；第Ⅱ亚群包括具有融合基因的禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）和内尔森海湾病毒（Nelson Bay virus，NBV）；第Ⅲ亚群包括狒狒呼肠孤病毒（Baboon reovirus，BRV）；从蛇分离到的两株呼肠孤病毒暂且将其归为第Ⅳ亚群[1-2]。其中禽呼肠孤病毒包含鸡源、火鸡源、鹅源、番鸭源的呼肠孤病毒。

新型鸭呼肠孤病毒（New-type duck reovirus，NDRV）病，是一种以肝脏不规则坏死、出血斑/点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病，各品种鸭（如番鸭、半番鸭、麻鸭、北京鸭等）均可感染发病。该病病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，一种分节段的dsRNA病毒[3]。NDRV含有10个RNA片段，即3 个大基因Ll、L2、L3，分别编码λA、λB、λC3 种蛋白；3 个中基因M1、M2、M3，分别编码μA、μB和μNS5 种蛋白；4 个小基因S1、S2、S3 和S4，分别编码P10、P18、σC、σA、σB和σNS6 种蛋白[4]。

本实验室从临床病料分离到1 株新型鸭呼肠孤病毒，并命名为NDRV-QY 株[5]。为了解QY 株病毒与其他正呼肠孤病毒的遗传进化关系，本试验将QY 株的S组基因核苷酸序列与国内外参考毒株进行了比对和分析，以初步明确该株病毒的分类地位。

1 材料与方法

1.1 病毒株及工程菌 新型鸭呼肠孤病毒（NDRVQY）、工程菌大肠杆菌DH5α感受态细胞由佛山科学技术学院生命科学学院传染病室提供。

1.2 主要试剂 RNAiso Reagent，购自美国Invitrogen 公司；反转录试剂盒、Premix ExTaqTMVersion2.0、pMD18-T 载体、DNAMarker（DL-2 000），均购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit（2000）为OMEGA公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物的设计与合成 参照GenBank 中登录的NDRVS1、S2、S3 和S4 基因序列（JX478256、JF320803、GQ888710、GU338025），用Primer Primer5.0 软件设计合成了覆盖S1、S2、S3 和S4 基因开放阅读框的多对特异性引物（见表1）。

表1 引物序列

1.4 病毒S组基因RT-PCR 扩增 按RNAiso Reagent 操作说明书提取病毒总RNA，随机引物和AMV反转录后作为模板，采用见表1 中引物进行PCR 扩增。PCR 反应条件为：94 ℃4 min；94 ℃50 s，55 ℃50 s，72 ℃1 min 20 s；进行30 个循环，最后72 ℃延伸10 min。琼脂糖凝胶纯化与回收PCR 产物，连接至pMD18-T 载体中，转化E.coliDH5α感受态细胞，铺氨苄抗性LB琼脂平板37 ℃倒置培养，经鉴定后挑取阳性菌落进行扩大培养，送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.5 S组基因核苷酸及其推导氨基酸序列分析利用DNAStar（Version 7.10）软件对测定的病毒核苷酸序列及其推导氨基酸序列与GenBank 中收录的正呼肠孤病毒属成员的核苷酸和推导氨基酸的序列进行同源性比对和分析。

2 结果

2.1 S1、S2、S3 基因和S4 基因的RT-PCR 扩增结果 利用S组各段基因特异性引物进行RT-PCR扩增，结果与预期相符。利用DNAStar 软件进行序列拼接，QY 株S1、S2、S3 基因和S4 基因核苷酸编码区序列已登录在GenBank 中，登录号分别为：KF689545、JQ863359、JQ866923、JQ922269。

2.2 S组基因编码区cDNA核苷酸序列和推导氨基酸序列的比较分析 S1 基因为多顺反子，编码区全长1 517bp，3 个部分重叠开放性阅读框（ORF）分别编码p10 蛋 白（ORF 为294，编 码97aa），功能未知的p18 蛋白（ORF 为489 bp，编码162aa）和σC蛋白（ORF 为966 bp，编码321aa）。DRV-QY 株σC蛋白编码区核苷酸序列与DRV的相似性为95.5%～97.5%，与MDRV的相似性为51.3%～52.3%，与ARV的相似性只有39.4%～40.9%。氨基酸序列相似性显示，DRV-QY 株与DRV的氨基酸序列相似性为96.0%～97.2%，与MDRV的相似性为42.6%～43.0%，与ARV的相似性为27.0%～29.9%。

S2 基因ORF 全长1 251 bp，编码由416 个氨基酸组成的σA蛋白。DRV-QY 株σA蛋白编码区核苷酸序列与DRV的相似性为88.1%～99.5%，与MDRV的相似性为85.8%～91.2%，与ARV的相似性为73.3%～74.8%。

S3 基因ORF 全长1 104 bp，编码由367 个氨基酸组成的σB蛋白。和氨基酸序列相似性分析表明，DRV-QY 株σB蛋白编码区核苷酸序列与DRV的相似性为96.6%～98.6%，与MDRV的相似性为66.5%～66.8%，与ARV和TRV的相似性为64.7%～67.6%。氨基酸序列相似性显示，DRVQY 株与DRV的氨基酸序列相似性为94.8%～98.4%，与MDRV的相似性为68.1%～68.9%，与ARV和TRV的相似性为67.0%～69.2%。

S4 基因ORF 全长1 104 bp，编码由367 个氨基酸组成的σNS蛋白。DRV-QY 株σNS蛋白编码区核苷酸序列与DRV的相似性为92.9%～99.2%，与MDRV的相似性为83.9%～85.0%，与ARV和TRV的相似性为76.6%～79.1%。

2.3 QY 株与其他正呼肠孤病毒的遗传进化关系QY 分离株S组核苷酸序列遗传进化分析表明，参比序列大致分为3 个亚群，即哺乳动物呼肠孤病毒（MRV）亚群，狒狒呼肠孤病毒（BRV）亚群及禽呼肠孤病毒（ARV）和内尔森海湾病毒（NBV）亚群。其中DRV、ARV、TRV、MDRV、NRV位于第二亚群，且NDRV-QY 与新近报道的新型鸭呼肠孤病毒DRV处于进化树的同一小分支，亲缘性较近（见图1）。

3 分析与讨论

本研究参考新型鸭呼肠孤病毒的S组基因序列设计特异性引物，对国内分离株NDRV-QY 的S组基因编码区进行RT-PCR 扩增、克隆及序列测定，表明QY 株S组基因片段所包含的主要ORF 大小分别为1 517 bp、1 251 bp、1 104 bp 和1 104 bp。

图1 基因σC、σA、σB和σNS的遗传发育树

各序列分析结果表明，QY 株的S组基因各节段编码区和GenBank中已有的ARV、TRV、MDRV、DRV、GRV均有不同程度的同源性，其中与DRV的同源性最高，核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达90%以上，与NBV、BRV、MRV同源性则为9.3%～59.4%，同源性较低。另外，QY 株与DRV、ARV、NBV、MRV的外壳蛋白，σC蛋白是由S1 基因编码[4，6，7]，而MDRV的σC蛋白则是由S4 基因编码的[8]。MDRV的S4 基因为多顺反子，但是QY 株和DRV、ARV、NBV的Sl基因包含3个开放阅读框（ORF）[4-11]。MDRV的S4基因缺少QY 株S1 的ORF2，不能表达p18 蛋白。以上结果表明，QY 株是有别于MDRV和ARV的新型鸭呼肠孤病毒，同时也说明我国家禽尤其是水禽体内存在着多种基因类群的呼肠孤病毒。

根据QY 株σC、σA、σB和σNS的遗传进化树分析表明，QY 株与DRV、MDRV、ARV同在正呼肠孤病毒的第Ⅱ亚群，是不同于MDRV和ARV的独立分支。QY 株与DRV具有很高的同源性且处在同一个分支，提示它们可能来自同一祖先。

由上述结果分析可知，NDRV与MDRV、ARV可能具有相同的祖先而进化成不同的分支，建议将NDRV归属为正呼肠孤病毒属的第Ⅱ亚群中。

[1]张云，刘明，欧阳岁东，等.正呼肠孤病毒及其分类学依据研究进展[J].动物医学进展，2004，25（6）：46-49.

[2]张忠信.ICTV第九次报告对病毒分类系统的一些修改[J].病毒学报，2012，28（5）：595-599.

[3]陈少莺，陈仕龙，林锋强，等.新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J].病毒学报，2012，28（3）：224-230.

[4]Wang Dan，Xu Feng，Ma Guo-ming，et al.Complete genomic sequence of a newmuscovy duck-origin reovirus from China[J].Journal of Virology，2012，86（22）：12445.

[5]袁远华，王俊峰，吴志新，等.1 株番鸭源新型鸭呼肠孤病毒（QY株）生物学鉴定[J].中国兽医学报，2013，33（8）：1174-1178.

[6]Martinez-Costas J，Grande A，Varela R，et al.Protein architec ture of avian reovirus S1133 and identification of the cell attachment protein[J].Journal of Virology，1997，71：59-64.

[7]Grande A，Costas C，Benavente J.Subunit composition and conformational stability of the oligomeric form of the avian reovirus cell-attachment protein sigma C[J].Journal of General Virology，2002，83：131-139.

[8]Kuntz-Simon G，Gall-Recule G L，Boisseson C，et al.Muscovy duck reovirus σCprotein is atypically eneoded by the smallest genome segment[J].Journal of General Virology，2002a，83：1189-1200.

[9]Shapouri MR，Kane M，Letartc M，et al.Cloning，sequencing and expression of the S1 gene of avian reovirus[J].Journal of General Virology，1995，76：1515-1520.

[10]Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay（TaqMan）for detection and classification of bovine viral diarrhea virus[J].Vet Microbiol，2001，83：1-10.

[11]Shmulevitz M，Yameen Z，Dawe S，et al.Sequential partially overlapping gene arrangement in the tricistronic S1 genome segments of avian reovirus and Nelson Bay reovirus：implications for translation initiation[J].Journal of Virology，2002，76：609-618.