不同接种途径和不同接种日龄对ALV-J感染模式的影响

黄小容，刘广芹，汪子豪，冯 敏，秦建如，郝建勇，李育豪，曹伟胜，廖 明

（华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点开放实验室，广东 广州 510642）

J亚群禽白血病病毒（Subgroup Javian Leukosis virus，ALV-J）最早是由Payne 等于1988 年从肉鸡中分离鉴定出的禽白血病/肉瘤病毒群的一个新的亚群，主要引起肉鸡的骨髓细胞瘤、血管瘤、纤维肉瘤、肾瘤等多种肿瘤。自从我国于1999 年[1]商品代肉鸡中分离到ALV-J以来，ALV-J的宿主范围已由肉鸡扩大到蛋鸡[2-3]以及地方品系鸡，如麻鸡[4]，黄鸡[5]和地方柴鸡[6]等。ALV-J除了引起肿瘤以外，还会导致免疫抑制和生产性能降低等表现。ALV-J已给我国养禽业造成巨大经济损失[7]。

目前防控鸡禽白血病主要采用净化方法[8-9]。评估ALV-J经不同途径及日龄感染鸡后感染模式的变化情况，对研究ALV-J的致病特点和防控有重要意义。综合Pandiri 等[10]和孙贝贝等[11]的研究发现，ALV-J病毒血症、抗体及排毒动态与病毒株、感染剂量、途径及年龄密切相关。因为不同毒株的感染模式之间存在差异性，所以有必要阐明不同流行毒株感染时这一流行病学特点。针对我国蛋鸡群中有血管瘤型ALV-J呈区域性流行的状况[12-15]，本研究拟系统性地评估血管瘤型ALV-J经不同接种途径和日龄接种对鸡感染模式的影响，从而为该病的净化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞和试剂 DF-1细胞来源于美国ATCC，ALV-J单克隆抗体JE9[16]由扬州大学秦爱建教授惠赠。血管瘤病变型克隆株ALV-JCHN06 株由农业部兽用疫苗创制重点开放实验室保存[17]，每0.2 mL感染细胞培养上清中含有104.5TCID50病毒。

1.2 隔离器 不锈钢正/负压鸡隔离器（GJ-1型），苏州市冯氏实验动物设备有限公司。

1.3 实验动物 11 日龄SPF 鸡胚（白来航），购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，经德州科裕KFK 微电脑全自动孵化机孵化。

1.4 试验设计 分别经11 日龄鸡胚尿囊腔，1 日龄口服、点眼滴鼻、腿部肌肉注射、颈部皮下注射、腹腔注射和7 日龄腹腔注射途径接种104.5TCID50/0.2 mL的ALV-JCHN06 感染细胞培养上清液，0.2 mL/只；对照组为1 日龄SPF 鸡经腹腔接种0.2 mL DMEM细胞培养液。除11日龄鸡胚尿囊腔组接种30枚鸡胚，出壳后随机挑选15 只健雏进行试验外，其余各组均接种15 只鸡。每只鸡带翅号，各组鸡分别置于不同的隔离器内饲养，自由采食和饮水。

1.5 样品采集和检测 各组鸡分别于接种后(11 日龄鸡胚尿囊腔组于出壳后)第1、2、4、6 周无菌采集非抗凝血，抗凝血和泄殖腔棉拭子。分离血清，用IDEXX ALV-J抗体ELISA试剂盒检测。血浆在DF-1 细胞上培养和泄殖腔棉拭子经冻融处理之后，取上清用IDEXX ALV抗原ELISA试剂盒检测。

2 结果与分析

2.1 不同感染方式下的病毒血症、抗体和泄殖腔排毒动态 如图1 所示，11 日龄鸡胚尿囊腔组的病毒血症和泄殖腔p27 抗原阳性率均自第4 周开始维持在峰值100%（15/15），6 周内均未检测到ALVJ抗体。1 日龄口服组和点眼滴鼻组各有53.3%（8/15）只鸡呈现一过性病毒血症，6 周内均未检测到ALV-J抗体，且第6 周才有6.7%（1/15）泄殖腔p27抗原检测为阳性。1 日龄颈部皮下注射组、腿部肌肉注射组和腹腔注射组的病毒血症阳性率和泄殖腔p27 抗原阳性率均分别在第2 周和第4 周达到峰值；第4 周时，1 日龄颈部皮下注射组和腹腔注射组的病毒血症阳性率下降，均为67%(10/15)，而1 日龄腿部肌肉注射组仍维持在峰值，差异显著（P＜0.05）；第4 周开始检测到ALV-J抗体，第6 周时，抗体阳性率在33%～47%之间，差异不显著。7 日龄腹腔注射组的病毒血症阳性率在第2 周达到峰值67%（10/15）后开始降低，第6 周降为0%（0/15），与1 日龄组差异显著（P＜0.05）。第4 周开始检测到ALV-J抗体，第6 周时，抗体阳性率高达93%(14/15)，与1 日龄注射组均差异显著（P＜0.05）。7 日龄腹腔注射组，泄殖腔p27 抗原阳性率一直维持在较低水平13%（2/15），与1 日龄组相比排毒时间推迟。

2.2 不同接种方式下的感染模式 如表1 所示，11 日龄鸡胚尿囊腔组感染模式以V+S+为主，感染鸡持续带毒排毒。1 日龄口服组和点眼滴鼻组以V-S-感染模式为主。1 日龄注射组第2 周的感染模式以V+S-为主，但1 日龄腿部肌肉注射组有33%（5/15）感染模式为V+S+，部分鸡开始带毒排毒；在第4、6 周的感染模式均以V+S+为主。7 日龄腹腔注射组在第2 周67%（10/15）的感染模式为V+S-，而第6 周80%（12/15）的感染模式为V-S-。

图1 ALV-J经不同途径和不同日龄感染SPF 鸡后的病毒血症、抗体和泄殖腔排毒动态

表1 ALV-J经不同接种途径和不同接种日龄接种SPF 鸡后的感染模式

3 讨论

不同接种途径对ALV-J感染模式影响的结果显示：注射途径比非注射途径更易诱导病毒血症和排毒：1 日龄口服组和点眼滴鼻组感染模式以V-S-为主，而1 日龄注射组以V+S+为主。注射途径中又以1日龄腿部肌肉注射组对病毒血症和排毒的影响大。原因可能与不同接种途径使得到达靶细胞的有效病毒量不同有关。口服和点眼滴鼻组因为黏膜屏障以及胃的消化作用的影响，进入细胞内的有效病毒剂量少，而腿部肌肉等血管丰富的部位，进入靶细胞内的有效病毒剂量多，且病毒可经血液快速在体内传播，病毒血症和泄殖腔排毒水平提高。

不同感染日龄对ALV-J感染模式影响的结果表明，随着感染日龄的增加，病毒血症持续时间缩短，排毒水平降低，抗体生成水平升高。11 日龄鸡胚尿囊腔接种的鸡均呈现V+S+的感染模式，这个结果与王小芬等[18]用该毒株在麻黄鸡上感染的结果一致，说明胚胎感染易导致ALV-J持续性病毒血症。相比1 日龄感染组，7 日龄腹腔注射组的病毒血症呈一过性，且第6 周的抗体阳性率显著增高。原因可能是随着年龄的增加，免疫器官的发育及成熟，鸡对病毒的抵抗力越强。

由本试验得知，ALV-J垂直传播，感染鸡持续带毒排毒，是水平感染和先天感染的主要来源。在早期水平传播过程中，ALV-J更容易经肌肉注射等注射途径传播。

[1]杜岩，崔治中，秦爱建，等.从市场商品肉鸡中检出J亚群禽白血病病毒[J].中国家禽，1999，3（1）：1-4.

[2]Xu BR，Dong WX，Yu CM，et al.Occurrence of avian leukosis virus subgroup Jin commercial layer flocks in China[J].Avian Pathol，2004，33（1）：13-17.

[3]辛朝安，曹伟胜，罗开健，等.鸡血管瘤型白血病诊断初报[J].养禽与禽病防治，2006，11：2.

[4]成子强，张利，刘思当，等.中国麻鸡中发现禽J亚群白血病[J].微生物学报，2005，45（4）：584-588.

[5]Sun SH，Cui Z Z.Epidemiological and pathological studies of subgroup Javian Leukosis virus infections in Chinese local“yellow”chickens[J].Avian Pathol，2007，36（3）：221-226.

[6]张洪海，刘青，邱波，等.地方柴鸡中J亚群禽白血病与马立克氏病的混合感染[J].畜牧兽医学报，2009，40（8）：1215-1221.

[7]Saif Y M.Diseases of Poultry[M].12th edition.Oxford：Blackwell Publishing，2008：514-568.

[8]秦爱建.禽白血病防控的思考[J].中国家禽，2011，15（12）：36-37.

[9]崔治中，孙淑红，赵鹏，等.对种鸡场禽白血病净化方案的建议[J].中国家禽，2014，18（01）：3-6.

[10]Pandiri AR，Reed WM，Mays JK，et al.Influence of strain,dose of virus，and age at inoculation on subgroup Javian Leukosis virus persistence,antibody response，and oncogenicity in commercial meattype chickens[J].Avian Dis，2007.51（3）：725-732.

[11]孙贝贝，崔治中，张青婵，等.ALV-J人工感染鸡病毒血症和抗体反应动态[J].中国农业科学，2009（11）：4069-4076.

[12]徐镔蕊，董卫星，余春明，等.用ALV-Jgp85 单克隆抗体证明蛋鸡存在J亚群禽白血病[J].畜牧兽医学报，2005，36（3）：269-271.

[13]刘玉山，宋敏训，连京华.血管瘤在我省蛋鸡群中的发生及流行[J].家禽科学，2009（9）：24-25.

[14]罗明星，周碧君，史开志，等.血管瘤型禽白血病的实验室诊断[J].山地农业生物学报，2009，28（1）：46-50.

[15]张小桃，赖汉漳，张贺楠，等.血管瘤相关禽白血病病毒CD08株的分离与鉴定[J].中国兽医杂志，2009，45（11）：8-10.

[16]Qin AJ，Lee L F，Fadly AM，et al.Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup Javian leukosis virus[J].Avian Dis，2001，45（4）：938-945.

[17]Lai H Z，Zhang H N，Ning Z Y，et al.Isolation and characterization of emerging subgroup Javian leukosis virus associated with hemangioma in egg-type chickens[J].Vet Microbiol，2011，151：275-283.

[18]王小芬，刘雪美，廖亚琳，等.J亚型禽白血病病毒感染黄鸡病毒血症和抗体反应动态的研究[J].中国畜牧兽医，2012（08）：174-178.