microRNA-199a/b-3p 对乳腺癌细胞运动能力的影响①

王子航 李春实 康劲松 米旭光 刘 磊 (延边大学医学院，延边 133002)

近年来，我国乳腺癌发病率的增长速度已高出原高发国家1～2 个百分点，且呈明显的年轻化趋势，每年有16.9 万妇女患乳腺癌，且发病率位居大城市女性肿瘤的第一位［1］。转移的发生是导致乳腺癌病人死亡的首要原因，转移一旦发生就极少治愈且预后不佳。晚期乳腺癌患者的平均生存时间只有18～30 个月［2，3］。同时，转移常伴随着对传统及实验性治疗方法的耐受性［4］。现有的治疗靶点和治疗药物对于组织学形态多种多样、高度异质性的乳腺癌仍显不足，因此，寻找抑制乳腺癌转移的新治疗靶点、新治疗手段是研究的重点，将极大改善患者的预后，提高总生存率。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 乳腺癌MDA-MB-231 细胞，人胚肾HEK293T 细胞使用含10%胎牛血清(四季青生物公司，中国)的DMEM 培养基(Invitrogen，USA)，添加含青霉素(100 kU/L)、链霉素(100 μg/ml)，37℃5%CO2条件下培养。

1.2 主要实验试剂耗材 Transwell 小室(Corning，美国)、基质胶(Sigma，美国)、microRNA-199a-3p mimcs(Biomics，中国)、D-luciferin(上海科敏生物科技有限公司，中国)、PVDF 膜(Millipore，德国)、鼠抗PAK4 和HRP 标记羊抗鼠二抗(CST，美国)、pRNAT-U6.1/Hygro-PAK4 干扰载体为本实验室构建、其他常规试剂(北京化工，中国)。

1.3 免疫印迹分析 提取细胞总蛋白后，进行常规SDS-PAGE 电泳转膜，TBST 配制的脱脂奶粉封闭液封闭24 h，标记鼠抗PAK4 一抗(1∶1 000)室温1.5 h，TBST 清洗3 次，标记HRP 标记羊抗鼠二抗(1∶1 000)，TBST 清洗3 次，ECL 显影。

1.4 迁移能力和细胞膜皱起动态分析的检测 在6 孔板中接种1 ×106个MDA-MB-231 细胞，培养24 h 贴壁后，转染相应质粒，24 h 后，记录12 min 总细胞面积变化，依照文献方法计算细胞膜皱起动态变化［5］;划线，拍照。继续培养，在24 h、48 h 时拍照，Image J 软件分析迁移能力。

1.5 侵袭能力的检测 用无血清的DMEM 培养基重悬细胞，饥饿24 h，然后调整细胞浓度为1 ×105ml-1，将200 μl 细胞悬液接种于Transwell(Transwell小室内预铺Matrigel 胶)小室的上室内;在24 孔板中加入600 μl 含有20% 胎牛血清的DMEM 培养基，然后将Transwell 小室放入24 孔板中;37℃5%CO2条件下培养24 h;取出Transwell 小室，用0.01 mol/L 的PBS 轻柔冲洗，然后用棉签轻柔擦除上室内粘附的细胞，在95%的乙醇中固定，最后采用结晶紫染色;在倒置显微镜下，随机选择5 个视野(×200)，观察穿透小室的细胞数量，取其平均值，每实验组设3 个重复，每组实验均重复3 次。

1.6 统计学分析 采用SPSS16.0 软件对所得数据进行统计分析，所得计量资料以±s 表示，组内比较采用配对t 检验，以P ＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌细胞中内源PAK4表达 在乳腺癌MDA-MB-231 细胞中，miR-199a/b-3p mimcs 转染组内源PAK4 蛋白表达被显著抑制(图1)。

2.2 miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌细胞迁移侵袭和细胞膜皱起 miR-199a/b-3p mimcs 转染24 h、48 h后，乳腺癌MDA-MB-231 细胞细胞迁移率分别为0.24 和0.46，与对照0.6 和0.92 相比显著降低(图2A)，P ＜0.05;miR-199a/b-3p mimcs 转染48 h 后，乳腺癌MDA-MB-231 细胞的侵袭率为0.21(图2B)和平均细胞膜皱起面积为2.4 μm2×103(图2C)均显著下降，P ＜0.05。

2.3 干扰PAK4 表达抑制MDA-MB-231 细胞迁移侵袭和细胞膜皱起 在乳腺癌MDA-MB-231 细胞中，转染PAK4 Si 24 h 后，检测PAK4 蛋白表达，与对照相比PAK4 蛋白表达量显著降低(图3A);抑制PAK4 表达24 h、48 h 后的MDA-MB-231 细胞细胞迁移率为0.3和0.7，与对照0.54和0.96(图3B)相比均显著下降，P ＜0.05;而抑制PAK4 表达48 h后，MDA-MB-231 细胞侵袭率0.51(图3C)和平均细胞膜皱起面积2.13 μm2×103(图3D)均显著下降，P ＜0.05。

图1 miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌MDA-MB-231 细胞内源PAK4 蛋白表达Fig.1 Expression of PAK4 inhibited by miR-199a/b-3p

图2 miR-199a/b-3p 抑制MDA-MB-231 迁移(A)，侵袭(B)和平均细胞膜皱起面积(C)Fig.2 Migration index (A)，invasion index (B)and average protrusive area (C)of MDA-MB-231 inhibited by miR-199a/b-3p

图3 MDA-MB-231 细胞中PAK4 表达量(A)，干扰PAK4 抑制迁移(B)，侵袭(C)和平均细胞膜皱起面积(D)Fig.3 Expression (A)，migration (B)，invasion (C)and average protrusive area (D)of PAK4 in MDA-MB-231 cellstransfected PAK4i

3 讨论

自1991 年至2010 年间，乳腺癌死亡率增长了32.89%，成为死亡率增长最快的癌症，其发病率位居大城市女性肿瘤的第一位［6］。我国城市中乳腺癌死亡率增长了38.91%，已成为对妇女健康威胁最大的疾病［7］。现在乳腺癌的治疗药物以蒽环类、诺维本、紫杉类和健择为主导，偏晚期乳腺癌恶性度高，应用化疗药物治疗则敏感率低副作用大，且预后差，易复发和转移［8］。microRNA(miRNA)是近年来发现的一类长度约为20～25 个核苷酸的具有转录后调节功能的非编码单链的小分子RNA［9］，并且microRNA 可通过胞外体、微囊泡等形式由细胞主动分泌至血液中，被受体细胞所摄取，从而调控受体细胞的功能，其异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关［10，11］。因此，miRNA 在肿瘤诊断、肿瘤分型、预后判断及基因治疗的作用越来越受到关注。

有研究显示miR-199a/b-3p 在多种肿瘤细胞中明显低表达，上调miR-199a/b-3p 可显著抑制肿瘤细胞的增殖［12，13］。由前期工作得知，miR-199a/b-3p在乳腺癌组织样本的表达水平与癌旁正常组织相比显著下调。这提示miR-199a/b-3p 可能在乳腺癌的存活发展中发挥重要作用，但其是否抑制乳腺癌的转移未见研究。因此，本研究拟探究miR-199a/b-3p对于乳腺癌转移的影响及相应的分子机制。在乳腺癌MDA-MB-231 细胞中超表达miR-199a/b-3p 后，细胞的迁移侵袭能力明显下降，说明miR-199a/b-3p具有抑制乳腺癌细胞转移的能力。膜皱起检测发现超表达miR-199a/b-3p 后，MDA-MB-231 平均膜皱起面积显著减少，提示miR-199a/b-3p 可抑制乳腺癌细胞运动能力。并且，miR-199a/b-3p 可以下调内源PAK4 蛋白的表达量，因此我们推测其抑制乳腺癌转移侵袭和膜皱起可能是通过下调PAK4 实现的。通过干涉内源的PAK4 表达，MDA-MB-231 细胞迁移侵袭能力明显减弱，平均膜皱起面积减少，说明miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌细胞运动能力至少部分是通过靶向抑制PAK4 表达实现的。

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