结肠癌组织VEGF 表达与树突状细胞浸润的临床意义及与血清VEGF浓度及其活化水平的相关性

张子杰 (河南省南阳市中心医院病理科，南阳 473009)

结肠癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一，近 年来，我国结肠癌的发病率逐年上升，目前已居于恶性肿瘤发病率的第二位［1］。肿瘤血管的形成是肿瘤发生中的必要条件，在肿瘤生长、浸润及转移方面都起着不可替代的作用。而肿瘤血管的新生是一个十分复杂的过程，受到多种因子调控，其中功能最强、特异性最高的是血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，它能够促进内皮细胞分裂、增殖和血管构建、迁移，增加血管通透性［2］。除决定肿瘤血管生成外，VEGF 还具有一定的免疫调节功能，能够降低机体内的免疫监视功能，从而促进免疫逃逸［3，4］。树突状细胞(Dendritic cells，DCs)在诱导、调节、维持机体抗肿瘤免疫中起核心作用，是目前已知的体内唯一能激活且功能最强的初始T 细胞的抗原提呈细胞［5］。有研究表明，肿瘤组织中浸润的DCs 存在成熟障碍，会导致机体无法进行有效的免疫反应［6］。已有报道表明［7］，结直肠癌患者外周血DCs 在肿瘤抗原刺激下诱导T淋巴细胞产生IL-10 而导致肿瘤免疫逃逸，DCs 数量和功能异常在结直肠癌发生、发展中具有重要的作用。本课题通过分析结肠癌组织中VEGF 的表达水平及血清VEGF 浓度与树突状细胞浸润及其活性的相关性，揭示VEGF 与DCs 在结肠癌发病及转移过程中的分子机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料 2011 年1 月～2013 年12 月经我院经病理学确诊接受结肠癌根治术的90 例结肠癌患者纳入本次研究。所有结肠癌患者术前均无接受过放疗、化疗，并且无长期接受非甾体消炎药、糖皮质激素类药以及其他影响患者免疫功能的药物。90例结肠癌患者中，男性59 例(65.56%)、女性31 例(34.44%);年龄范围26～83 岁，平均年龄(52.73±12.40)岁。所有病理标本切除后测量最大直径，在肿瘤中心取标本进行HE 染色，明确浸润程度、分化程度和病理分期。取肿瘤组织外2cm 癌旁组织作为对照，并经过病理检查排除累及肿瘤。90 例结肠癌患者，肿瘤TNM 分期Ⅰ期13 例(14.44%)、Ⅱ期15 例(16.67)、Ⅲ期35 例(38.89%)、Ⅳ期27 例(30.00%);黏膜下层浸润37 例(41.11%)、黏膜层浸润53 例(58.89%);左半结肠52 例(57.78%)，右半结肠38 例(42.22%);高度分化20 例(22.22%)、中度分化23 例(25.56%)和低度分化47 例(52.22%);无淋巴结转移49 例(54.44%)、有淋巴结转移41 例(45.56%)。随机选取30 例结肠癌患者术前抽取空腹肘静脉血，其中男性21 例(70.00%)，女性9 例(30.00%)，年龄范围27～78岁，平均年龄(52.26±11.73)岁，另选择同期行健康体检受试者30 例作为对照，其中男性20 例(66.67%)、女性10 例(33.33%)，年龄范围25～80，平均年龄为(51.64±13.27)岁。本研究得到医院伦理委员会的批准，并且所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂和仪器 兔抗人单克隆抗体VEGF、兔抗人S-100 多克隆抗体、ABC 试剂、DAB 试剂盒，均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供;人VEGF ELISA 检测试剂盒，由深圳达科为公司提供;FITC-CD83，由美国BD 公司提供;外周血淋巴细胞分离液(Ficoll)，由挪威Axis-shield 公司提供。EXL808 全自动酶标仪，由美国BIO-TEK 公司提供;FACS Calibur cytometer 和Cell Quest 软件，均由美国BD Biosciences 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法测定组织中VEGF 及S-100 蛋白的表达 采用免疫组化Envision 两步法。使用10% 甲醛溶液固定标本后，经脱水和石蜡包埋处理。4 μm 连续切片，经脱蜡和梯度酒精水化后，使用pH 8.0 的EDTA 在95℃～99℃下水浴抗原修复，冷却至室温后，使用2%山羊血清在室温条件下封闭30 min，滴加VEGF 或S-100 一抗后4℃过夜，PBS 洗涤，加生物素二抗工作液37℃孵育30 min，滴加ABC 试剂，PBS 洗涤，DAB 显色，使用苏木精复染后，常规梯度乙醇脱水，使用二甲苯做透明处理后，用中性树胶封片。阴性对照选择PBS，阳性对照选择已知的VEGF 或S-100 阳性切片，分别以VEGF和S-蛋白染色结果评分表示VEGF 的表达强度和DCs 的浸润程度。以细胞浆中出现棕黄色颗粒者判定为VEGF 或DCs 阳性，以阳性染色细胞百分数及染色强度计分评判染色结果，染色结果评分为阳性染色细胞计数评分和染色强度评分之积，阴性(-)评分＜1 分，弱阳性(+)2～3 分，中度阳性(++)4～5 分，强阳性(+++)＞5 分。

1.3.2 酶联免疫吸附试验检测血清VEGF 浓度外周血VEGF 水平的测定，采用双抗夹心ELISA 法，严格按试剂盒所提供的说明进行操作。主要步骤:加抗体包被，4℃过夜，洗涤，抛干;加待检抗原，37℃30 min，洗涤，抛干;加酶标抗体，37℃30 min，洗涤，抛干;加底物液，37℃15 min，加终止液;用ELISA检测仪测定OD 值。各检测孔内VEGF 浓度标准曲线根据标准品的标准曲线来计算。

1.3.3 DCs 活化水平的测定 外周血单核细胞利用Ficoll 分离，离心收集上清液，冻存于-70℃冰箱中备用。将单核细胞复苏，调整细胞密度为5 ×106个/ml，将细胞铺于24 孔板中于37℃5%CO2孵箱培养，培养第5 天加入TNF-α 促进DCs 成熟。收集收获的DCs，加入FITC-CD83，4℃孵育30 min，PBS洗涤，多聚甲醛固定，采用FACS Calibur cytometer 对获得DCs 中成熟DC 进行计数，以流量200 μl 为限，对照调零后检测CD83 细胞含量，并推算原细胞悬液中CD83 DC 总量。

1.4 统计学分析 数据统计分析使用SPSS13.0。计量资料以±s 表示，采用独立样本t 检验进行两组间的比较，采用ANOVA 分析进行多组间比较;计数资料采用χ2检验，以百分率表示，等级资料采用秩和检验;相关性采用Spearman 等级相关分析。P＜0.05 在统计学上有显著性差异。

2 结果

2.1 结肠癌组织和正常结肠组织VEGF 和S-100蛋白阳性表达率的比较 结肠癌组织和结肠癌旁组织VEGF 和S-100 蛋白阳性表达差异具有统计学意义(P ＜0.01)，具体见表1。结肠癌组织VEGF 阳性表达率分别为47.78%(43/90)，较结肠癌旁组织显著提高(χ2值=47.232，P=0.000)。结肠癌组织S-100 蛋白阳性表达率为47.78%(43/90)，较结肠癌旁组织显著降低(χ2=3.895，P=0.048)。

2.2 结肠癌患者和健康受试者外周血VEGF 水平和DCs 活化水平的比较 结肠癌患者外周血VEGF水平较健康受试者显著升高，而外周血DCs 中CD83 水平较健康受试者显著降低，差异均具有统计学意义(P ＜0.01)，具体见表2。

2.3 VEGF 和S-100 蛋白在结肠癌中的表达与临床病理关系的单因素分析 VEGF 和S-100 蛋白的表达与结肠癌临床病理参数之间的关系见表3。VEGF 和S-100 蛋白的表达与患者年龄、性别、浸润程度和肿瘤位置不相关(P ＞0.05)，但是与肿瘤分期、分化程度和淋巴结转移相关(P ＜0.01)。

2.4 结肠癌组织VEGF 和DCs 浸润程度的相关性分析 相关分析结果显示(见表4)，VEGF 表达强度与DCs 浸润程度呈负相关(rs=-0.445，P=0.008)。

2.5 结肠癌组织VEGF 表达与外周血VEGF 水平和DCs 活化水平的相关性分析 相关分析结果显示，结肠癌组织VEGF 表达与外周血VEGF 正相关(rs=0.613，P=0.000)，与DCs 活化水平负相关(rs=0.426，P=0.010)。

2.6 结肠癌组织DCs 浸润程度与外周血VEGF 水平和DCs 活化水平的相关性分析 相关分析结果显示，结肠癌组织DCs 浸润程度与外周血VEGF 负相关(rs=-0.527，P=0.006)，与DCs 活化水平正相关(rs=0.645，P=0.010)。

表1 结肠癌组织和正常结肠组织VEGF 和S-100 蛋白阳性表达率的比较Tab.1 VEGF and S-100 protein positive rate in colon cancer tissue and normal pericarcinous tissue

表2 结肠癌患者和健康受试者外周血VEGF 水平和DCs活化水平的比较Tab.2 Sera VEGF and DCs activation level in colon cancer patients and healthy subjects

表4 结肠癌组织VEGF 和DCs 浸润程度的相关性分析Tab.4 Correlation between VEGF expression and DCs infiltration in colon cancer tissues

表3 VEGF 和S-100 蛋白在结肠癌中的表达与临床病理的关系Tab.3 Correlation between VEGF，S-100 protein expression and clinical pathological features in colon cancer

3 讨论

微环境中血管形成因子VEGF 与肿瘤血管的生成密切相关。VEGF 是新生血管形成的中心调控因子，是重要的促进血管生成因子，在恶性肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用，并且瘤细胞表达VEGF 是肿瘤具备侵袭性的必需条件［8］。VEGF 广泛表达于多种细胞，包括内皮细胞及肿瘤细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞，且以肿瘤细胞和内皮细胞为主，表达具有一定的异质性。VEGF 与血管内皮细胞生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)特异性结合，通过旁分泌途径刺激肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移并形成新生的血管［9］。此外，VEGF 还可以促进成纤维细胞、单核细胞及内皮细胞的浸润，增强血管通透性，有利于肿瘤基质的形成，以此促进肿瘤转移的活性［10，11］。本研究结果显示，结肠癌患者外周血VEGF 水平较健康受试者显著升高(P ＜0.01)，并且结肠癌组织VEGF 阳性表达率较结肠癌旁组织显著增加(P ＜0.01)。分析结肠癌组织VEGF 阳性表达率与结肠癌临床病理参数关系的结果显示，VEGF表达与肿瘤分期、分化程度和淋巴结转移相关(P ＜0.01)，提示VEGF 参与结肠癌的发生和发展。

DCs 能够启动机体的免疫反应，不需要其他任何刺激因子的存在，是目前已知的体内唯一能激活的且功能最强的初始T 细胞的抗原提呈细胞。DCs具有摄取、处理和提呈抗原的能力，能活化初始T细胞和增殖记忆性T 细胞，在启动、调控和维持T细胞免疫应答中发挥重要作用。DCs 可通过表达抗原刺激信号和共刺激信号启动免疫应答［12］。髓样细胞的不正常分化会造成DCs 功能障碍，导致成熟DCs 数量下降以及部分黏附分子、幼稚型树突状细胞(Immature dendritic cell，iDC)和不成熟髓样细胞增加等。iDCs 有较强的摄取和处理抗原能力，且会诱导T 细胞的免疫耐受［13］，因此只有成熟型树突状细胞(Mature dendritic cell，mDC)将抗原提呈并激活初始CD4+和CD8+T 细胞［14］，发挥特异性抗肿瘤免疫效应［15］。多种肿瘤患者体内存在DCs 功能障碍或iDCS 增多的现象，不能有效地递呈肿瘤抗原，加之DCs 表面共刺激分子和黏附分子的低表达或不表达，使得抗肿瘤免疫的核心产生CD8+的细胞毒性淋巴细胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)无法有效识别、杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫逃逸的主要原因［16］。S-100 蛋白是一组可溶性、低分子量、高酸性的蛋白质，特异性表达于DCs 细胞质和细胞核上，而单核细胞和巨噬细胞内不表达S-100，因此S-100 蛋白可作为肿瘤浸润树突状细胞的特异性标记物［17］。本研究结果显示，结肠癌组织S-100 蛋白阳性表达率较结肠癌旁组织显著降低(P ＜0.05)，S-100 蛋白的表达与肿瘤分期、分化程度和淋巴结转移相关(P ＜0.01)，提示DCs 浸润参与结肠癌的发生和发展。已有研究显示，肿瘤组织内肿瘤细胞和局部浸润的DCs 之间存在相互作用，来源于肿瘤细胞的IL-10、TGF-B、PGE2，可以诱导局部浸润的DCs，使其具有免疫调节和耐受活性［18］。

DCs 在提呈抗原之前以未成熟状态iDC 遍布全身各组织器官，一旦iDC 捕获抗原，可迅速分化为mDC，mDC 细胞膜上组织相容性抗原Ⅱ类分子表达上调，淋巴细胞功能相关抗原T 淋巴细胞活化辅助分子表达明显升高，并出现DCs 成熟标志CD83［19］。因此，本研究采用CD83 水平作为外周血DCs 的活化水平。本研究结果显示，而外周血DCs 中CD83水平较健康受试者显著降低，结肠癌患者体内DCs活化水平降低，导致机体免疫调节和耐受活性降低。研究显示，VEGF 可抑制DCs 细胞分化以及DCs 活性而介导免疫逃逸［20］。相关性分析结果显示，结肠癌组织VEGF 表达强度与结肠癌组织DCs 浸润程度和外周血DCs 活化水平呈负相关(P ＜0.01)，外周血VEGF 水平与结肠癌组织DCs 浸润程度以及外周血DCs 活化水平呈负相关(P ＜0.01)，提示VEGF可抑制DCs 的浸润和活化。

总之，结肠癌组织VEGF 表达和DCs 浸润可能共同参与结肠癌的进展，并且VEGF 可抑制DCs 浸润和活化。

［1］姜毅楠，蔡 逊，马丹丹，等.趋化因子受体1 在人结肠癌中的表达及其与肿瘤转移的相关性研究［J］.华中科技大学学报(医学版)，2014，43(4):427-430.

［2］白丽淼，黄晓峰，徐寒梅.人结肠癌HT-29 移植瘤不同生长阶段微血管密度及相关因子的表达研究［J］.中国药理学通报，2014，30(6):796-800.

［3］Kim H，Kataru RP，Koh GY.Regulation and implications of inflammatory lymphangiogenesis［J］.Trends Immunol，2012，33(7):350-356.

［4］Sheng KC，Wright MD，Apostolopoulos V.Inflammatory mediators hold the key to dendritic cell suppression and tumor progression［J］.Curr Med Chem，2011，18(36):5507-5518.

［5］Whiteside TI.Antitum or vaccines in head and neck cancer:targeting immune responses to the tumor［J］.Curr Cancer Drug Targets，2007，7(7):633-642.

［6］Pinzon-Chatty A，Maxwell Lopez JA.Dendritic cell dysfunction in cancer:a mechanism for immunosuppression［J］.Immunol Cell Biol，2005，83(5):451-461.

［7］秦建民，盛 霞，杨 林，等.树突状细胞功能异常对结直肠癌肝转移的影响［J］.中华普通外科杂志，2011，26(5):371-376.

［8］Malhot L，Stenninger J.Behavior of seeds and soil in the mechanism of metastasis:a deeper understanding［J］.Cancer Sci，2012，103(4):626-631.

［9］Jemal A，Bray F，center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69-90.

［10］Tie J，Desai J.Antiangiogenic therapies targeting the vascular endothelia growth factor signaling system［J］.Crit Rev Oncog，2012，17(1):51-67.

［11］Eichmann A，Simons M.VEGF signaling inside vascular endothelial cells and beyond［J］.Curr Opin Cell Biol，2012，24(2):188-193.

［12］仇江辉，黄礼明，赵国静，等.扶正透毒祛毒复方对髓系微小残留白血病患者CD 34 +细胞源树突状细胞的影响［J］.北京中医药大学学报，2013，36(9):612-616.

［13］Delirezh N，Moazzeni SM，Shokri F，et al.Autologous dendritic cells loaded with apoptotic tumor cells induce T cell mediated immune responses against breast cancer in vitro［J］.Cell Immunol，2009，257(1/2):23-31.

［14］郝建朋，郭金帅，郭大伟，等.自然成熟型树突状细胞对CD4+CD25+调节性T 细胞扩增的影响［J］.中国现代普通外科进展，2011，17(1):12-16.

［15］Fujii S，Takayama T，Asakura M，et al.Dendritic cell based cancer immunotherapies［J］.Arch Immunol Ther Exp，2009，57(3):189-198.

［16］Kawakam IY.Cancer treatment by comprehensive regulation of antitumor immune network［J］.Nippon Rinsho，2010，68(6):1094-1099.

［17］Lu L，Qian S，Hershberger PA，et al.Fas ligand(CD95L)and B7 expressoin on endritic cells provide counter-regulatory signals for T cell survival and proliferation［J］.J Immunol，1997，158(12):5676-5684.

［18］Ma Y，Shurin GV，Gutkin DW，et al.Tumor associated regulatory dendritic cells［J］.Semin Cancer Biol，2012，22(4):298-306.

［19］王 颖，张利荣，吴德平贝氏柯克斯体重组蛋白对树突状细胞活化作用分析［J］.中华传染病杂志，2011，29(11):653-659.

［20］肖炜明，吴克艳，龚卫娟，等.胃癌组织VEGF 表达及血清VEGF 浓度与DCs 浸润及其活性的关联分析［J］.中国免疫学杂志，2013，2(7):700-705.