CD4+ CD25+ Foxp3+ 调节性T 细胞在HDCP 外周血中水平变化及其意义

张义东 王青青 (浙江省德清县人民医院，德清 313200)

妊娠期高血压疾病是指血压正常妇女在怀孕20 周后发生血压升高、双下肢严重水肿和蛋白尿等症状，该病是妊娠妇女的特有疾病，严重危及母婴的健康，也是产妇和围生儿死亡的重要原因。随着人们对规范产检的重视逐渐提高，HDCP 的发病率呈上升趋势。HDCP 的发病机制和致病因素至今尚不清楚，故临床上针对该病并无很好的预防措施。胚胎在子宫腔内成功的生长发育与母体的免疫耐受有着莫大的关系，如果母体的免疫耐受发生紊乱，可引起孕妇发生自然性流产和HDCP 等病理性妊娠［1］。CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞在机体的免疫耐受中起到重要作用［2］。本文研究CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞在妊娠期高血压疾病发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013 年1 月至2014 年8 月在我院治疗的妊娠期高血压疾病(HDCP)患者，纳入标准:(1)诊断符合第7 版《妇产科学》关于HDCP 诊断标准;(2)患者均为初产妇，无其他产科并发症;(3)患者及家属知情同意，能配合研究。排除标准:(1)有肝肾心等重要脏器疾病;(2)结核以及血液系统疾病史;(3)有输血及免疫治疗史。本次研究共纳入患者46 例，其中轻度子痫前期22 例，重度子痫前期24 例，同时选取同期正常孕妇25 例，三组孕妇在年龄、孕周等一般资料比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

1.2 实验仪器及试剂 FITC 荧光标记的抗人CD抗体、PE 标记的抗人CD25 抗体、PE-Cy5 标记的Foxp3 试剂盒。所有抗体均购自eBioscience 公司。

1.3 检测方法 采用真空抗凝管抽取所有患者肘静脉血5 ml 左右，采用淋巴细胞分离液制备外周血单个核细胞，采用PBS 洗涤后制备单细胞悬液。细胞表面染色:取150 μl 外周血单个核细胞悬液，加入2 ml PBS，1 000 r/min 离心5 min 后弃去上清，然后500 μl 的PBS 重悬将细胞稀释到1 ×106ml-1，向其中加入10 μl 的FITC 标记的CD4 抗体和PE 标记的CD25 抗体，室温避光30 min，加入2 ml 冷PBS，1 000 r/min，5 min 离心洗涤。细胞内染色:采用1 ml 破膜剂重悬细胞，室温避光孵育1 h 后，加入1 ml透膜缓冲液，离心洗涤2 次后重悬，加入10 μl 的PE-Cy5 标记的Foxp3 抗体，室温避光30 min，加入2 ml 冷PBS，1 000 r/min，5 min 离心，然后加入500 μl PBS 重悬。设置相应的对照管。流式细胞仪［BD FACSCALIBUR;BD Bioscience(U.S.A.)］检测。

雌三醇水平测定:抽取所有患者肘静脉血约5 ml，采用顺磁性颗粒化学发光免疫测定法按照游离雌三醇定量检测试剂盒(河南美凯生物科技有限公司，规格:48 人份/盒)的说明书进行操作测定患者外周血中游离雌三醇的水平。

1.4 统计学处理 应用采用SPSS19.0 统计软件进行统计分析，计量资料采用±s 表示，比较使用方差分析，两两比较使用LSD 检验，以P ＜0.05 表示差异具有统计学意义。

表1 三组一般资料比较(±s)Tab.1 Three groups general data comparison(±s)

表1 三组一般资料比较(±s)Tab.1 Three groups general data comparison(±s)

2 结果

2.1 各组外周血CD4+CD25+T 细胞比例情况 重度子痫前期组CD4+CD25+T 细胞比例为(5.01±1.04)%，低于轻度子痫前期组的(7.38±1.26)%和正常组的12.59±2.48)%，差异有统计学意义(P＜0.05);轻度子痫前期组CD4+CD25+T 细胞比例明显低于正常组(P ＜0.05)。见表2。

2.2 各组外周血CD4+CD25+Foxp3+T 细胞情况轻度子痫前期组和重度子痫前期组CD4+CD25+Foxp3+T 细胞绝对数分别为(0.96±0.11)×107和(0.63± 0.12)× 107，CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 分别为(2.58±0.93)%和(1.84±0.85)%，均低于正常组的(1.85± 0.17)× 107和(5.11±0.99)%，差异有统计学意义(P ＜0.05);重度子痫前期组CD4+CD25+Foxp3+T 细胞绝对数和CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 比例均低于轻度子痫前期组(P ＜0.05)。见表3，图1。

表2 各组外周血CD4 +CD25 +T 细胞比例情况(±s)Tab.2 Each group peripheral blood CD4 + CD25 + T cell percentage(±s)

表2 各组外周血CD4 +CD25 +T 细胞比例情况(±s)Tab.2 Each group peripheral blood CD4 + CD25 + T cell percentage(±s)

Note:1)with normal group comparison of P ＜0.05;2)with severe pre-eclampsia group comparison of P ＜0.05.

表3 各组外周血CD4 +CD25 + Foxp3 +T 细胞情况(±s)Tab.3 Each groups peripheral blood CD4 + CD25 +Foxp3 +T cells(±s)

表3 各组外周血CD4 +CD25 + Foxp3 +T 细胞情况(±s)Tab.3 Each groups peripheral blood CD4 + CD25 +Foxp3 +T cells(±s)

Note:1)with normal group comparison of P ＜0.05;2)with severe pre-eclampsia group comparison of P ＜0.05.

图1 流式细胞仪分析Fig.1 Flow cytomeric analysis

表4 各组血清雌三醇情况(±s)Tab.4 Each groups serum estriol(±s)

表4 各组血清雌三醇情况(±s)Tab.4 Each groups serum estriol(±s)

Note:1)with normal group comparison of P ＜0.05;2)with severe pre-eclampsia group comparison of P ＜0.05.

2.3 各组血清雌三醇情况 轻度子痫前期组和重度子痫前期组血清雌三醇分别为(6.16±2.17)mg/L 和(3.27±1.15)mg/L，明显低于正常组的(11.34±2.4)mg/L，差异有统计学意义(P ＜0.05);轻度子痫前期组血清雌三醇高于重度子痫前期组(P ＜0.05)。见表4。

3 讨论

妊娠期高血压疾病在疾病早期，患者多无任何的不适，部分孕妇可有轻微的头痛头晕，血压小幅度升高;病情较重者常见的临床症状为头痛，眼晕眼花，重度高血压和蛋白尿。HDCP 孕妇的临床检查措施包括孕妇特殊检查(眼底检查、凝血功能和心肝肾等重要脏器功能检查)和胎儿的检查(胎儿发育状况，胎儿宫内情况和脐动脉血运)，临床上主要根据患者的病史、临床症状和辅助检查等综合诊断该疾病。HDCP 治疗的主要目的是为了避免病情进展到重度子痫前期和子痫，尽可能降低产妇和新生儿死亡，提高母婴的生命安全。HDCP 的主要治疗措施包括卧床休息，硫酸镁解痉，选择合理降压药降低血压，利尿，根据患者的具体情况进行适度镇静，必要时可终止妊娠。

免疫耐受是胚胎成功生长发育的关键，其发生机制可能为人体内MHCⅠ类抗原分子的缺如和补体调节蛋白的表达和局部免疫抑制［3］。CD4+CD25+调节性T 细胞(Treg)在免疫耐受中发挥重要作用，它可保证内环境的稳定，抑制机体对异体物质的排斥和影响其他T 细胞的功能。据报道，CD4+CD25+调节性T 细胞在妊娠早期分泌逐渐增多，直至分娩后该细胞一直处于高水平［4］。本文发现正常孕妇组体内CD4+CD25+调节性T 细胞水平明显高于妊娠高血压孕妇，重度子痫前期组较轻度子痫前期组该细胞水平明显降低，与相关报道结果一致［5］，说明CD4+CD25+调节性T 细胞参与HDCP的发病。

Foxp3 是一种转录因子，存在于细胞质内，调控着CD4+CD25+调节性T 细胞的功能。研究已证实［6］，Foxp3 的mRNA 和其转录反映的蛋白质特异性作用于CD4+CD25+调节性T 细胞。正常妊娠过程中CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞在妊娠早期明显增加，中期稍微减弱，分娩后明显减少，但妊娠期高血压疾病可引起该细胞水平下降，病情越重其含量越低，重度子痫前期该细胞含量最低。本文结果论证了上述观点，说明CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞参与妊娠高血压疾病发生、发展的调节。

研究报道，采用雌激素进行体外刺激可增加Foxp3 的表达，可促进CD4+CD25+调节性T 细胞的增殖分裂，使其数量增多［7］。因此，人体内雌激素的水平对妊娠结局具有重要影响，它对妊娠过程中的免疫耐受也具有重要的作用。妊娠期间T 淋巴细胞发生明显偏移，雌三醇可抑制该过程的发生，并促使T 淋巴细胞分化为Th2 型淋巴细胞，增强调节性T 细胞的活性，促进其功能［8］。本文重症子痫轻度子痫前期组和重度子痫前期组CD4+CD25+Foxp3+T 细胞绝对数量和血清雌三醇浓度均明显低于正常妊娠组，说明CD4+CD25+Foxp3+T 细胞数量减少和雌三醇低水平无法维持机体的免疫耐受状态，可能造成病理性妊娠，如妊娠期高血压疾病。

CD4+CD25+调节性T 细胞及相关的细胞因子在机体免疫系统中占有举足轻重的地位，它们的主要功能是抑制机体的免疫活性，抑制机体对移植物的排斥作用。CD4+CD25+调节性T 细胞对自身免疫性疾病的治疗具有广阔的应用前景［9］。已有研究证实，调节性T 细胞用于自发性流产的实验研究，具有很好的调节作用［10］。

总而言之，妊娠高血压疾病患者CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞明显减少，同时血清雌三醇也有所降低，这些可能与妊娠期高血压疾病的发病机制以及免疫耐受有关。CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞在妊娠高血压疾病的发病机制中占据重要地位，后续研究应进一步研究妊娠高血压疾病的发病机制，为临床防治提供理论依据。

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